2, 000 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर सभी एंटीबॉडी के स्टॉक समाधान तैयार करके शुरू करें। फिर प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, कमजोर पड़ने वाली ट्यूबों को उनके संबंधित सांद्रता के साथ लेबल करें, जिसमें एंटीबॉडी का नाम भी शामिल है। पीबीएस-टीबीएन वाहन केवल नियंत्रण के रूप में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक खाली ट्यूब भी शामिल करें।
इसके बाद, पीबीएस-टीबीएन के 75 माइक्रोलीटर को सभी एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले ट्यूबों में 500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और नीचे के रूप में लेबल किया गया है, जिसमें वाहन केवल नियंत्रण ट्यूब शामिल हैं। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, पिपेट 150 माइक्रोलीटर प्रति मिलीलीटर के रूप में लेबल ट्यूब में स्टॉक समाधान के 000 माइक्रोलीटर। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक पूर्ण कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाने के लिए, श्रृंखला में बाद के निचले कमजोर पड़ने के लिए 1, 000 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ट्यूब से 75 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।
बाद में, नए पूर्ण कमजोर पड़ने ट्यूब को बंद करें और संक्षेप में इसे भंवर करें। फिर 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के निर्दिष्ट कुओं में पतला एंटीबॉडी के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद हर प्रतिक्रिया में बायोटिनिलेटेड पुनः संयोजक मानव पीडीएल 1 के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक पन्नी या प्लास्टिक चिपकने वाला सील के साथ माइक्रोटिटर प्लेट को कवर करें और 600 आरपीएम पर एक कक्षीय प्लेट शेकर पर मिलाते हुए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
अगला, पुनः संयोजक मानव PD1 युग्मित मोती पीबीएस-TBN के साथ प्रति मिलीलीटर 50, 000 मोती की एकाग्रता के लिए पतला. शेकर से 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर रिएक्शन प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को छील दें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पुनः संयोजक मानव PD1 युग्मित मनका मिश्रण के 50 microliters जोड़ें.
प्लेट को कसकर सील करें और 600 आरपीएम पर सेट कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें। फिर मोतियों को स्थिर करने के लिए दो मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर प्लेट रखें।
पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से जुड़े हुए हैं। प्लेट को पलटें और सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से त्याग दें। मोतियों से अतिरिक्त प्रतिक्रिया अभिकर्मकों को धोने के लिए, चुंबकीय प्लेट विभाजक से माइक्रोटिटर प्लेट को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।
मुहर को हटाने और मोतियों immobilizing के रूप में प्रदर्शन के बाद, चुंबक और microtiter प्लेट सुरक्षित हैं और सतह पर तैरनेवाला डंप की पुष्टि करते हैं. अब अच्छी तरह से प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए SAPE काम समाधान के 100 microliters जोड़ने के लिए और pipetting द्वारा मोती resuspend. प्लेट को सील करें और इसे अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
फिर ध्यान से चिपकने वाली प्लेट मुहर को हटा दें एक बार मोती स्थिर हो जाते हैं और साथ ही चुंबक और प्लेट एक साथ सुरक्षित हो जाते हैं। धीरे थाली उलटा द्वारा सतह पर तैरनेवाला डंप. मोतियों से अतिरिक्त SAPE धोने के लिए, चुंबकीय प्लेट धारक से microtiter प्लेट को हटा दें और मोतियों resuspended करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-TBN के 150 microliters जोड़ें.
फिर दो मिनट के लिए एक चुंबकीय प्लेट विभाजक पर माइक्रोटिटर प्लेट रखकर मोतियों को स्थिर करें। चुंबक और microtiter प्लेट सुरक्षित है कि पुष्टि करने के बाद, थाली पलटना और सतह पर तैरनेवाला हटा दें. इसके बाद, पतला ब्रिलियंट वायलेट 421 संयुग्मित एंटी-ह्यूमन या एंटी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी के 100 माइक्रोलीटर को उनके संबंधित कुओं में जोड़ें।
प्लेट को सील करें और इसे कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर मोतियों को स्थिर करें और चिपकने वाली प्लेट सीलर को हटा दें। पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित हैं और सतह पर तैरनेवाला डंप करें।
मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस-टीबीएन के 150 माइक्रोलीटर जोड़कर मोतियों से अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को धो लें। अगला, मोतियों immobilize करने के लिए दो मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर microtiter प्लेट जगह है. पुष्टि करें कि चुंबक और माइक्रोटिटर प्लेट सुरक्षित रूप से एक साथ हैं और फिर प्लेट को उल्टा करें और सतह पर तैरनेवाला डंप करें।
एक बार चौथे और अंतिम धोने बफर हटा दिया जाता है, चुंबकीय प्लेट विभाजक से microtiter प्लेट बाहर ले. एक विंदुक का प्रयोग, अच्छी तरह से पीबीएस TBN के 100 microliters में मोती resuspension. अंत में, प्रत्येक प्रतिक्रिया की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता निर्धारित करने के लिए, 50 माइक्रोलीटर, 100 मोतियों के लिए न्यूनतम मनका गिनती, 40 सेकंड के लिए टाइमआउट सेटिंग, 7, 000 से 17, 000 तक की आकांक्षा मात्रा के साथ दोहरी रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण प्रणाली पर प्लेट पढ़ें, और दोहरी रिपोर्टर को ऑपरेटिंग मोड।
सभी चार पॉलीक्लोनल एंटी-PDL1 पेप्टाइड एंटीबॉडी ने PD1 के साथ पुनः संयोजक मानव PDL1 इंटरैक्शन को अवरुद्ध कर दिया। विभिन्न एंटी-पीडीएल 1 पेप्टाइड एंटीबॉडी के निषेध का प्रतिशत 48% से 74% तक 1, 000 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अधिकतम परीक्षण एकाग्रता पर था। सकारात्मक नियंत्रण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी atezolizumab ने प्रति मिलीलीटर चार माइक्रोग्राम की अधिकतम परीक्षण एकाग्रता पर PD1-PDL1 इंटरैक्शन के 92% नाकाबंदी को प्राप्त किया।
पुनः संयोजक मानव PDL1 के लिए PDL1 वैक्स-प्रेरित उम्मीदवार एंटीबॉडी के तुलनात्मक बाध्यकारी विश्लेषण ने संकेत दिया कि सभी चार पॉलीक्लोनल एंटी-PDL1 पेप्टाइड एंटीबॉडी एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से पुनः संयोजक मानव PDL1 से बंधे हैं। एंटी-PDL1(130) एंटीबॉडी ने चार PDL1 वैक्स-प्रेरित एंटीबॉडी उम्मीदवारों के उच्चतम RH PDL1 बाइंडिंग सिग्नल को दिखाया।
