まず、すべての抗体のストック溶液を2, 000マイクログラム/ミリリットルで調製します。次に、各抗体について、抗体の名前を含むそれぞれの濃度で希釈チューブに標識します。また、PBS-TBNビヒクルのみのコントロールとして各抗体のブランクチューブを含めます。
次に、500マイクログラム/ミリリットル以下のラベルが貼付されているすべての抗体希釈チューブに、ビヒクル専用のコントロールチューブを含め、75マイクロリットルのPBS-TBNを添加します。各抗体について、150マイクロリットルの原液を1,000マイクログラム/ミリリットルと表示されたチューブにピペットで移動します。各抗体の完全な希釈シリーズを作成するには、1ミリリットルあたり1, 000マイクログラムのチューブから75マイクロリットルをシリーズの後続のより低い希釈に移します。
その後、新しく完成した希釈チューブを閉じ、短時間ボルテックスします。次に、25マイクロリットルの希釈抗体を96ウェルマイクロタイタープレートの指定されたウェルに添加し、続いて25マイクロリットルのビオチン化組換えヒトPDL1をすべての反応ウェルに添加します。マイクロタイタープレートをホイルまたはプラスチックの粘着シールで覆い、オービタルプレートシェーカーで600 RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートします。
次に、組換えヒトPD1結合ビーズをPBS-TBNで1ミリリットルあたり50, 000ビーズの濃度に希釈する。96ウェルマイクロタイター反応プレートをシェーカーから取り外し、接着プレートシールをはがします。50マイクロリットルの組換えヒトPD1結合ビーズ混合物を各ウェルに加えます。
プレートをしっかりと密封し、600 RPMに設定されたオービタルシェーカーで室温で暗所で1時間インキュベートします。インキュベーション後、粘着プレートシールを慎重に取り外します。次に、プレートを磁気プレートセパレーターに2分間置き、ビーズを固定します。
磁石とマイクロタイタープレートがしっかりと接続されていることを確認してください。プレートを裏返し、上澄み液を慎重に廃棄します。ビーズから余分な反応試薬を洗浄するには、磁気プレートセパレーターからマイクロタイタープレートを取り外し、各ウェルに150マイクロリットルのPBS-TBNを追加します。
図のようにシーラーを取り外し、ビーズを固定した後、磁石とマイクロタイタープレートが固定されていることを確認し、上澄みを捨てます。次に、100マイクロリットルのSAPEワーキング溶液を各反応ウェルに加え、ピペッティングでビーズを再懸濁します。プレートを密封し、暗所で室温で1時間インキュベートします。
次に、ビーズが固定され、磁石とプレートが一緒に固定されたら、粘着プレートシーラーを慎重に取り外します。プレートをひっくり返して上澄みを静かに捨てます。ビーズから余分なSAPEを洗い流すには、磁気プレートホルダーからマイクロタイタープレートを取り外し、各ウェルに150マイクロリットルのPBS-TBNを加えてビーズを再懸濁します。
次に、マイクロタイタープレートを磁気プレートセパレーターに2分間置いてビーズを固定します。磁石とマイクロタイタープレートが固定されていることを確認したら、プレートを反転させて上澄み液を取り除きます。次に、希釈したBrilliant Violet 421抱合抗ヒト免疫グロブリンGまたは抗ウサギ免疫グロブリンGをそれぞれのウェルに加えます。
プレートを密封し、室温で暗所で1時間インキュベートします。次に、ビーズを固定し、粘着プレートシーラーを取り外します。磁石とマイクロタイタープレートが固定されていることを確認し、上澄みを捨てます。
各ウェルに150マイクロリットルのPBS-TBNを添加してビーズから余分な二次抗体を洗浄し、ビーズを再懸濁します。次に、マイクロタイタープレートを磁気プレートセパレーターに2分間置き、ビーズを固定します。磁石とマイクロタイタープレートがしっかりとくっついていることを確認してから、プレートを反転させて上清を捨てます。
4番目で最後の洗浄バッファーが除去されたら、磁気プレートセパレーターからマイクロタイタープレートを取り出します。ピペットを使用して、ビーズをウェルあたり100マイクロリットルのPBS-TBNに再懸濁します。最後に、各反応の蛍光強度の中央値を決定するために、吸引量を50マイクロリットル、最小ビーズ数を100ビーズ、タイムアウト設定を40秒、ゲート範囲を7、000〜17、000、動作モードをデュアルレポーターに設定したデュアルレポーターフロー分析システムでプレートを読み取ります。
4つのポリクローナル抗PDL1ペプチド抗体はすべて、組換えヒトPDL1とPD1の相互作用をブロックしました。異なった反PDL1ペプチッド抗体の阻止のパーセントは48%から74%に1ミリリットルあたり1、000マイクログラムの最高のテストされた集中で及んだ。ポジティブコントロールモノクローナル抗体アテゾリズマブは、最大試験濃度4マイクログラム/ミリリットルでPD1-PDL1相互作用の92%遮断を達成しました。
組換えヒトPDL1に対するPDL1ワクチン誘導候補抗体の比較結合解析により、4つのポリクローナル抗PDL1ペプチド抗体すべてが、濃度依存的に組換えヒトPDL1に結合することが示されました。抗PDL1(130)抗体は、4つのPDL1 vax誘導抗体候補の中で最も高いRH PDL1結合シグナルを示しました。
