밀리리터당 2, 000마이크로그램에서 모든 항체의 원액을 준비하여 시작하십시오. 그런 다음 각 항체에 대해 희석 튜브에 항체 이름을 포함하여 각각의 농도로 라벨을 붙입니다. 또한 PBS-TBN 차량 전용 제어로 각 항체에 대한 빈 튜브를 포함합니다.
다음으로, 차량 전용 제어 튜브를 포함하여 밀리리터당 500마이크로그램 이하로 표시된 모든 항체 희석 튜브에 75마이크로리터의 PBS-TBN을 추가합니다. 각 항체를 위해, 1로 레테르를 붙인 관으로 원액의 150 마이크로리터를 피펫팅, 밀리리터 당 000 마이크로그램. 각 항체를 위한 완전한 희석 시리즈를 창조하기 위하여는, 1개에서 시리즈의 연속적인 더 낮은 희석액에 밀리리터 관 당 000 마이크로그램에서 75 마이크로리터를 옮기십시오.
그런 다음 새로 완성된 희석 튜브를 닫고 잠시 소용돌이칩니다. 그런 다음 희석된 항체 25마이크로리터를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 지정된 웰에 추가한 다음 모든 반응 웰에 25마이크로리터의 비오틴화 재조합 인간 PDL1을 추가합니다. 마이크로타이터 플레이트를 호일 또는 플라스틱 접착 씰로 덮고 600RPM의 궤도 플레이트 셰이커에서 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
다음에, 재조합형 인간적인 PD1에 의하여 결합된 구슬을 50의 농도에 의 PBS-TBN를 가진 밀리리터 당 000의 구슬을 묽게 하십시오. Shaker에서 96웰 마이크로타이터 반응판을 제거하고 접착판 밀봉을 박리합니다. 재조합 인간 PD1 결합 비드 혼합물 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.
플레이트를 단단히 밀봉하고 600RPM으로 설정된 오비탈 셰이커에서 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 접착판 씰을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 마그네틱 플레이트 분리기에 플레이트를 2분 동안 놓아 비드를 고정합니다.
자석과 마이크로타이터 플레이트가 단단히 연결되었는지 확인합니다. 접시를 뒤집고 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 비드에서 과잉 반응 시약을 세척하려면 마그네틱 플레이트 분리기에서 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 각 웰에 150마이크로리터의 PBS-TBN을 추가합니다.
실러를 제거하고 그림과 같이 비드를 고정한 후 자석과 마이크로타이터 플레이트가 고정되어 있고 상층액을 버리는지 확인합니다. 이제 각 반응에 100 마이크로리터의 SAPE 작동 용액을 웰에 추가하고 피펫팅으로 비드를 재현탁합니다. 플레이트를 밀봉하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 비드가 고정되고 자석과 플레이트가 함께 고정되면 접착 플레이트 실러를 조심스럽게 제거합니다. 플레이트를 뒤집어 상층액을 부드럽게 버립니다. 비드에서 과도한 SAPE를 씻어내려면 마그네틱 플레이트 홀더에서 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 각 웰에 150마이크로리터의 PBS-TBN을 추가하여 비드를 재현탁합니다.
그런 다음 마이크로타이터 플레이트를 자성 플레이트 분리기에 2분 동안 놓아 비드를 고정합니다. 자석과 마이크로타이터 플레이트가 고정되었는지 확인한 후 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거합니다. 다음으로, 희석된 Brilliant Violet 421 복합 항인간 또는 항토끼 면역글로불린 G 100마이크로리터를 각각의 웰에 추가합니다.
플레이트를 밀봉하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 비드를 고정하고 접착판 실러를 제거합니다. 자석과 마이크로타이터 플레이트가 고정되어 있는지 확인하고 상층액을 버립니다.
비드를 재현탁시키기 위해 각 웰에 150마이크로리터의 PBS-TBN을 첨가하여 비드에서 과잉 2차 항체를 세척합니다. 다음으로, 마이크로타이터 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 2분 동안 놓아 비드를 고정합니다. 자석과 마이크로타이터 플레이트가 단단히 결합되어 있는지 확인한 다음 플레이트를 뒤집고 상층액을 버립니다.
네 번째이자 마지막 세척 버퍼가 제거되면 마그네틱 플레이트 분리기에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼냅니다. 피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터의 PBS-TBN에 비드를 재현탁시킵니다. 마지막으로, 각 반응의 평균 형광 강도를 결정하기 위해 흡인 부피를 50마이크로리터로, 최소 비드 수를 100개의 비드로, 타임아웃 설정을 40초로, 게이팅 범위를 7, 000에서 17, 000으로, 작동 모드를 듀얼 리포터로 설정한 듀얼 리포터 유동 분석 시스템의 플레이트를 판독합니다.
4개의 다클론 항-PDL1 펩타이드 항체 모두 재조합 인간 PDL1과 PD1의 상호작용을 차단했습니다. 다른 반대로 PDL1 펩티드 항체의 금지의 백분율은 48%to에서 74%at 1의 최대 시험한 농도, 밀리리터 당 000 마이크로그램 배열했다. 양성 대조군 단클론 항체 아테졸리주맙은 밀리리터당 4마이크로그램의 최대 테스트 농도에서 PD1-PDL1 상호작용의 92% 차단을 달성했습니다.
재조합 인간 PDL1에 대한 PDL1 vax 유도 후보 항체의 비교 결합 분석은 4개의 다클론 항-PDL1 펩타이드 항체 모두 농도 의존적 방식으로 재조합 인간 PDL1에 결합하는 것으로 나타났습니다. 항 PDL1(130) 항체는 4개의 PDL1 vax 유도 항체 후보 중 가장 높은 RH PDL1 결합 신호를 보였다.
