Start med å forberede stamløsninger av alle antistoffer ved 2.000 mikrogram per milliliter. Deretter merker du fortynningsrørene med deres respektive konsentrasjoner for hvert antistoff, inkludert navnet på antistoffet. Inkluder også et tomt rør for hvert antistoff som PBS-TBN kjøretøy bare kontroll.
Deretter legger du til 75 mikroliter PBS-TBN til alle antistofffortynningsrør merket som 500 mikrogram per milliliter og under, inkludert kjøretøyets eneste kontrollrør. For hvert antistoff, pipett 150 mikroliter av stamoppløsningen inn i røret merket som 1.000 mikrogram per milliliter. For å lage en komplett fortynningsserie for hvert antistoff, overfør 75 mikroliter fra 1.000 mikrogram per milliliter rør til den etterfølgende nedre fortynningen i serien.
Etterpå lukker du det nylig fullførte fortynningsrøret og virvler det kort. Deretter tilsettes 25 mikroliter fortynnede antistoffer i de angitte brønnene i en 96-brønns mikrotiterplate, etterfulgt av tilsetning av 25 mikroliter biotinylert rekombinant human PDL1 til hver reaksjonsbrønn. Dekk mikrotiterplaten med en folie- eller plastlimforsegling og inkuber ved romtemperatur i en time med risting på en orbital platerister ved 600 o / min.
Deretter fortynnes de rekombinante humane PD1-koblede perlene til en konsentrasjon på 50.000 perler per milliliter med PBS-TBN. Fjern den 96-brønns mikrotiterreaksjonsplaten fra shakeren og riv den selvklebende plateforseglingen. Tilsett 50 mikroliter av den rekombinante humane PD1-koblede perleblandingen til hver brønn.
Forsegle platen tett og rug i en time i mørket ved romtemperatur på en orbital shaker satt til 600 RPM. Etter inkubering, fjern forsiktig limplateforseglingen. Plasser deretter platen på magnetplateseparatoren i to minutter for å immobilisere perlene.
Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig tilkoblet. Snu platen og kast supernatanten forsiktig. For å vaske overflødig reaksjonsreagenser fra perlene, fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren og tilsett 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønn.
Etter å ha fjernet forsegleren og immobilisert perlene som demonstrert, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er sikret og dumpet supernatanten. Legg nå 100 mikroliter SAPE-arbeidsløsning til hver reaksjonsbrønn og resuspender perlene ved pipettering. Forsegl platen og inkuber den i en time ved romtemperatur i mørket.
Fjern deretter den selvklebende plateforsegleren forsiktig når perlene er immobilisert, så vel som magneten og platen er festet sammen. Dump supernatanten forsiktig ved å snu platen. For å vaske overflødig SAPE av perlene, fjern mikrotiterplaten fra magnetplateholderen og tilsett 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene.
Immobiliser deretter perlene ved å plassere mikrotiterplaten på en magnetplateseparator i to minutter. Etter å ha bekreftet at magneten og mikrotiterplaten er festet, snu platen og fjern supernatanten. Deretter tilsettes 100 mikroliter fortynnet Brilliant Violet 421 konjugert anti-humant eller anti-kaninimmunoglobulin G til deres respektive brønner.
Forsegl platen og inkuber den i en time i mørket ved romtemperatur. Immobiliser deretter perlene og fjern den selvklebende plateforsegleren. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er sikret og dump supernatanten.
Vask de overskytende sekundære antistoffene fra perlene ved å tilsette 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene. Deretter plasserer du mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i to minutter for å immobilisere perlene. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu deretter platen og dump supernatanten.
Når den fjerde og siste vaskebufferen er fjernet, tar du ut mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren. Bruk en pipette til å resuspendere perlene i 100 mikroliter PBS-TBN per brønn. Til slutt, for å bestemme median fluorescerende intensitet for hver reaksjon, les platen på dual reporter flow analysis system med aspirasjonsvolumet satt til 50 mikroliter, minimum perle teller til 100 perler, tidsavbrudd innstillingen til 40 sekunder, gating rekkevidde til 7.000 til 17.000, og driftsmodus til dual reporter.
Alle fire polyklonale anti-PDL1 peptidantistoffer blokkerte den rekombinante humane PDL1-interaksjonen med PD1. Prosentandelen av inhibering av de forskjellige anti-PDL1-peptidantistoffene varierte fra 48% til 74% ved den maksimale testede konsentrasjonen på 1.000 mikrogram per milliliter. Det positive kontrollmonoklonale antistoffet atezolizumab oppnådde 92 % blokade av PD1-PDL1-interaksjonen ved den maksimalt testede konsentrasjonen på fire mikrogram per milliliter.
Komparativ bindingsanalyse av PDL1 vax-induserte kandidatantistoffer mot rekombinant human PDL1 indikerte at alle fire polyklonale anti-PDL1 peptidantistoffer bundet til rekombinant humant PDL1 på en konsentrasjonsavhengig måte. Anti-PDL1(130)antistoffet viste det høyeste RH PDL1-bindingssignalet av de fire PDL1 vax-induserte antistoffkandidatene.
