Börja med att bereda stamlösningar av alla antikroppar med 2 000 mikrogram per milliliter. För varje antikropp märks sedan spädningsrören med deras respektive koncentrationer, inklusive namnet på antikroppen. Inkludera även ett blankrör för varje antikropp som endast PBS-TBN-fordonskontroll.
Tillsätt sedan 75 mikroliter PBS-TBN till alla antikroppsutspädningsrör märkta som 500 mikrogram per milliliter och lägre, inklusive endast fordonskontrollrören. För varje antikropp pipetteras 150 mikroliter av stamlösningen i röret märkt som 1 000 mikrogram per milliliter. För att skapa en komplett spädningsserie för varje antikropp, överför 75 mikroliter från tuben på 1 000 mikrogram per milliliter till den efterföljande lägre spädningen i serien.
Stäng sedan det nyligen färdiga utspädningsröret och virvla det kort. Tillsätt sedan 25 mikroliter utspädda antikroppar i de avsedda brunnarna på en 96-håls mikrotiterplatta, följt av tillsats av 25 mikroliter biotinylerad rekombinant human PDL1 till varje reaktionsbrunn. Täck mikrotiterplattan med en självhäftande tätning av folie eller plast och inkubera i rumstemperatur i en timme med skakning på en orbitalplattskakare vid 600 varv per minut.
Späd sedan de rekombinanta humana PD1-kopplade pärlorna till en koncentration av 50 000 pärlor per milliliter med PBS-TBN. Ta bort 96-brunnars mikrotiterreaktionsplattan från shakern och dra av den självhäftande plattans tätning. Tillsätt 50 mikroliter av den rekombinanta humana PD1-kopplade pärlblandningen till varje brunn.
Förslut plattan ordentligt och inkubera i en timme i mörker vid rumstemperatur på en orbitalskakapparat inställd på 600 varv per minut. Efter inkubationen, ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning. Placera sedan plattan på magnetplattseparatorn i två minuter för att immobilisera pärlorna.
Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är ordentligt anslutna. Vänd på plattan och kassera supernatanten försiktigt. För att tvätta överskottet av reaktionsreagenser från pärlorna, ta bort mikrotiterplattan från magnetplattseparatorn och tillsätt 150 mikroliter PBS-TBN till varje brunn.
Efter att ha tagit bort förseglaren och immobiliserat pärlorna enligt bilden, kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är säkrade och dumpat supernatanten. Tillsätt nu 100 mikroliter SAPE-arbetslösning till varje reaktionsbrunn och återsuspendera pärlorna genom pipettering. Förslut plattan och inkubera den i en timme i rumstemperatur i mörker.
Ta sedan försiktigt bort den självhäftande plattans försegling när pärlorna är immobiliserade samt magneten och plattan är säkrade tillsammans. Dumpa försiktigt supernatanten genom att vända plattan upp och ner. För att tvätta bort överflödig SAPE från pärlorna, ta bort mikrotiterplattan från magnetplattans hållare och tillsätt 150 mikroliter PBS-TBN till varje brunn för att återsuspendera pärlorna.
Immobilisera sedan pärlorna genom att placera mikrotiterplattan på en magnetisk plattseparator i två minuter. Efter att ha bekräftat att magneten och mikrotiterplattan är säkrade, vänd på plattan och ta bort supernatanten. Tillsätt sedan 100 mikroliter utspädd Brilliant Violet 421 konjugerad anti-human eller anti-rabbit immunoglobulin G till deras respektive brunnar.
Försegla plattan och inkubera den i en timme i mörker i rumstemperatur. Immobilisera sedan pärlorna och ta bort den självhäftande plattans förseglare. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan är säkrade och dumpa supernatanten.
Tvätta överskottet av sekundära antikroppar från kulorna genom att tillsätta 150 mikroliter PBS-TBN i varje brunn för att återsuspendera kulorna. Placera sedan mikrotiterplattan på magnetplattans separator i två minuter för att immobilisera pärlorna. Kontrollera att magneten och mikrotiterplattan sitter ordentligt ihop och vänd sedan upp och ner på plattan och dumpa supernatanten.
När den fjärde och sista tvättbufferten har tagits bort, ta ut mikrotiterplattan från magnetplattavskiljaren. Använd en pipett och återsuspendera pärlorna i 100 mikroliter PBS-TBN per brunn. Slutligen, för att bestämma medianlysningsintensiteten för varje reaktion, läs av plattan på det dubbla rapportflödesanalyssystemet med aspirationsvolymen inställd på 50 mikroliter, minsta pärlantal till 100 pärlor, timeout-inställningen till 40 sekunder, gating-intervallet till 7 000 till 17 000 och driftläge till den dubbla reportern.
Alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar blockerade den rekombinanta interaktionen mellan människa och PD1. Den procentuella hämningen av de olika anti-PDL1-peptidantikropparna varierade från 48 % till 74 % vid den maximala testade koncentrationen på 1 000 mikrogram per milliliter. Den monoklonala antikroppen atezolizumab med positiv kontroll uppnådde 92 % blockad av PD1-PDL1-interaktionen vid den maximala testade koncentrationen på fyra mikrogram per milliliter.
Jämförande bindningsanalys av PDL1 vax-inducerade kandidatantikroppar mot rekombinant human PDL1 indikerade att alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar band till rekombinant human PDL1 på ett koncentrationsberoende sätt. Anti-PDL1(130)antikroppen uppvisade den högsta RH PDL1-bindningssignalen av de fyra PDL1 vax-inducerade antikroppskandidaterna.
