Mililitre başına 2.000 mikrogramda tüm antikorların stok çözeltilerini hazırlayarak başlayın. Daha sonra her antikor için, seyreltme tüplerini antikorun adı da dahil olmak üzere ilgili konsantrasyonlarıyla etiketleyin. Ayrıca, yalnızca PBS-TBN araç kontrolü olarak her antikor için boş bir tüp ekleyin.
Daha sonra, sadece araç kontrol tüpleri de dahil olmak üzere, mililitre başına 500 mikrogram ve altı olarak etiketlenmiş tüm antikor seyreltme tüplerine 75 mikrolitre PBS-TBN ekleyin. Her antikor için, 150 mikrolitre stok çözeltisini mililitre başına 1.000 mikrogram olarak etiketlenmiş tüpe pipetleyin. Her antikor için tam bir seyreltme serisi oluşturmak için, mililitre tüpte 1.000 mikrogramdan 75 mikrolitreyi serideki sonraki düşük seyreltmeye aktarın.
Daha sonra, yeni tamamlanan seyreltme tüpünü kapatın ve kısaca vorteksleyin. Daha sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının belirlenmiş oyuklarına 25 mikrolitre seyreltilmiş antikor ekleyin, ardından her reaksiyon kuyucuğuna 25 mikrolitre biyotinillenmiş rekombinant insan PDL1 ekleyin. Mikrotitre plakasını bir folyo veya plastik yapışkan conta ile örtün ve 600 RPM'de bir orbital plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Daha sonra, rekombinant insan PD1 bağlı boncukları PBS-TBN ile mililitre başına 50.000 boncuk konsantrasyonuna seyreltin. 96 oyuklu mikrotitre reaksiyon plakasını çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını soyun. Her oyuğa 50 mikrolitre rekombinant insan PD1 bağlı boncuk karışımı ekleyin.
Plakayı sıkıca kapatın ve 600 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın. Ardından, boncukları hareketsiz hale getirmek için plakayı iki dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bağlandığını onaylayın. Plakayı ters çevirin ve süpernatanı dikkatlice atın. Boncuklardan fazla reaksiyon reaktiflerini yıkamak için, mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın ve her oyuğa 150 mikrolitre PBS-TBN ekleyin.
Sızdırmazlık maddesini çıkardıktan ve boncukları gösterildiği gibi hareketsiz hale getirdikten sonra, mıknatıs ve mikrotitre plakasının sabitlendiğini ve süpernatanı boşalttığını onaylayın. Şimdi her reaksiyona 100 mikrolitre SAPE çalışma solüsyonu ekleyin ve pipetleme ile boncukları yeniden süspanse edin. Plakayı kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Ardından, boncuklar hareketsiz hale getirildikten ve mıknatıs ve plaka birbirine sabitlendikten sonra yapışkan plaka kapatıcıyı dikkatlice çıkarın. Plakayı ters çevirerek süpernatanı yavaşça boşaltın. Boncuklardaki fazla SAPE'yi yıkamak için, mikrotitre plakasını manyetik plaka tutucusundan çıkarın ve boncukları yeniden süspanse etmek için her bir oyuğa 150 mikrolitre PBS-TBN ekleyin.
Ardından, mikrotitre plakasını iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcıya yerleştirerek boncukları hareketsiz hale getirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının sabitlendiğini onayladıktan sonra, plakayı ters çevirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, ilgili kuyucuklarına 100 mikrolitre seyreltilmiş Brilliant Violet 421 konjuge anti-insan veya anti-tavşan immünoglobulin G ekleyin.
Plakayı kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından boncukları hareketsiz hale getirin ve yapışkan plaka kapatıcıyı çıkarın. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının sabitlendiğini onaylayın ve süpernatanı boşaltın.
Boncukları yeniden süspanse etmek için her bir oyuğa 150 mikrolitre PBS-TBN ekleyerek boncuklardaki fazla ikincil antikorları yıkayın. Ardından, boncukları hareketsiz hale getirmek için mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıya iki dakika boyunca yerleştirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve ardından plakayı ters çevirin ve süpernatanı boşaltın.
Dördüncü ve son yıkama tamponu çıkarıldıktan sonra, mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın. Bir pipet kullanarak, boncukları oyuk başına 100 mikrolitre PBS-TBN'de yeniden süspanse edin. Son olarak, her reaksiyonun medyan floresan yoğunluğunu belirlemek için, aspirasyon hacmi 50 mikrolitreye, minimum boncuk sayısı 100 boncuk, zaman aşımı ayarı 40 saniyeye, geçit aralığı 7.000 ila 17.000'e ayarlanmış çift raportör akış analiz sistemindeki plakayı okuyun ve çalışma modu çift raportöre.
Dört poliklonal anti-PDL1 peptit antikorunun tümü, PD1 ile rekombinant insan PDL1 etkileşimini bloke etti. Farklı anti-PDL1 peptit antikorlarının inhibisyon yüzdesi, mililitre başına 1.000 mikrogramlık maksimum test edilen konsantrasyonda% 48 ila% 74 arasında değişmektedir. Pozitif kontrol monoklonal antikoru atezolizumab, mililitre başına dört mikrogramlık maksimum test edilen konsantrasyonda PD1-PDL1 etkileşiminin% 92 blokajını elde etti.
PDL1 vax ile indüklenen aday antikorların rekombinant insan PDL1'e karşılaştırmalı bağlanma analizi, dört poliklonal anti-PDL1 peptit antikorunun tümünün konsantrasyona bağlı bir şekilde rekombinant insan PDL1'e bağlandığını gösterdi. Anti-PDL1(130) antikoru, dört PDL1 vax ile indüklenen antikor adayının en yüksek RH PDL1 bağlanma sinyalini gösterdi.
