Name: TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

tev protease-mediated elution and denaturation elution of the chromatin locus purified from saccharomyces cerevisiae

בידוד כרומטין ספציפי ללוקוס מתאי שמרים

The dynamic organization of eukaryotic genomes into chromatin compacts the DNA to fit within the confines of the nucleus while ensuring sufficient dynamics for gene expression and accessibility for regulatory factors. In part, this versatility is mediated by the nucleosome, the basic unit of chromatin, which comprises a core particle with 147 bp of DNA wrapped ~1.7 times around the histone octamer1. The nucleosome is a highly dynamic structure with respect to its composition, with numerous histone variants and posttranslational modifications (PTMs) on the N- and C-terminal histone tails. Furthermore, eukaryotic chromatin interacts with a multitude of other essential components, such as transcription factors, DNA and RNA processing machinery, architectural proteins, enzymes involved in chromatin remodeling and modification, and RNA molecules associated with chromatin. These crucial machineries involved in transcription, replication, and repair all require access to chromatin, which serves as the natural substrate for these processes. Consequently, comprehending the molecular mechanisms underlying these DNA transactions necessitates a precise definition of the collective alterations in chromatin structure at the specific genomic regions where these machineries converge and facilitate biological reactions.
Despite the identification of numerous chromatin factors through genetics and protein-protein interaction studies, performing direct, unbiased, and comprehensive analyses of chromatin interactions at particular genomic sites has remained a significant obstacle2,3. Initially, only highly abundant regions of the genome (i.e., repetitive loci) or multi-copy plasmids could be isolated in sufficient amounts and purity for mass spectrometric identification of the associated proteins4,5,6,7. A series of new approaches based on the direct hybridization of capture probes to chromatinized DNA, proximity biotinylation using the CRISPR-dCas9 system, or the binding of sequence-specific adapter proteins to the locus of interest have started to unravel the proteome of single-copy loci from yeast and mammalian genomes8,9,10. However, all these methods require formaldehyde crosslinking to stabilize the protein-DNA interactions and sonication to solubilize the chromatin for subsequent purification. Together, both manipulations exclude the possibility of subsequent structural and functional studies of the purified chromatin.
To overcome these limitations, we previously devised a methodology that employs site-specific recombination to extract targeted chromosomal domains from yeast11,12. In essence, the genomic region of interest is surrounded by recognition sites (RS) for the site-specific R-recombinase from Zygosaccharomyces rouxi while simultaneously incorporating a group of three DNA binding sites for the prokaryotic transcriptional repressor LexA protein (LexA) within the same region. The yeast cells contain an expression cassette for the simultaneous expression of R-recombinase and a LexA protein fused to a tandem affinity purification (TAP) tag. After the induction of R-recombinase, the enzyme efficiently excises the targeted region from the chromosome in the form of a circular chromatin domain. This domain can be purified via the LexA-TAP adapter protein, which binds to the LexA DNA binding sites, as well as to an affinity support. This method has been recently used to isolate distinct chromatin domains containing selected replication origins of yeast chromosome III13.
One major advantage of this ex vivo approach is that it allows for functional analyses of the isolated material. For example, replication origin domains purified with this method can be subjected to in vitro replication assays to assess the efficiency of origin firing in a test tube from native in vivo assembled chromatin templates. Ultimately, the biochemical and functional characterization of the isolated material may allow the reconstitution of nuclear processes using purified proteins together with the native chromatin template. In summary, this methodology opens an exciting avenue in chromatin research, as it will be possible to follow the collective compositional and structural chromatin changes of a specific genomic region undergoing a certain chromosomal transaction.

מחבר זרקור: קידום מחקר הכרומטין והתגברות על מגבלות באמצעות פרוטוקול בידוד כרומטין ספציפי למוקד בהעשרה גבוהה 

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

A eukaryotic nucleus is very crowded with many biological processes occurring simultaneously. The scope of our research is to understand how all of these processes are coordinated on our genomes without major accidents that would otherwise lead to genomic instability and human diseases. This protocol allows us to purify a specific locus of the genome in its native state, allowing both the compositional and functional characterization of the isolated material, such as the measurements of protein DNA interactions.This protocol enables an enormous level of enrichment of a targeted locus, which overcomes many current limitations of locus-specific chromatin isolation. The material has not been cross-linked. That also allows many downstream functional analysis, such as in vitro transcription or in vitro replication.This protocol enabled us to excise and purify distinct replication origins from yeast chromosomes, allowing us to perform a proteomic analysis and identify novel origin interacting chromatin factors, and therefore, advance the research field of DNA replication. This protocol enables in vitro replication studies using the purified origin material to examine chromatin states, histone modifications, and perform structural analysis on the native nucleosomal templates from endogenous chromosomes, advancing chromatin research.

Watch this Scientific Journal Video about TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae  

TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus מטוהר מ-Saccharomyces cerevisiae

שחררו את קומפלקסי טבעות הכרומטין של lexA CBP מהחרוזים המגנטיים המשמשים לטיהור מוקד הגן של כרומטין בעותק יחיד על ידי דגירה על הדבורים בשני מיקרוליטרים של וירוס טבק רקומביננטי 6xHis-tagged או TEV protease. לאחר הפרדת הדבורים מהדבורים הסופיות באמצעות העברת מדף מגנטי, הפולט המכיל טבעות כרומטין שסועות לצינור תגובה חדש של 1.5 מיליליטר. שוב, הניחו את הצינורות על מדף מגנטי כדי להפריד בין שאריות החרוזים לבין הפלוט הסופי.השהה מחדש את החרוזים ב 750 מיקרוליטר של חיץ אמוניום פחמתי קר לפני אחסון כמה דגימות ב 20 צלזיוס לניתוח DNA וחלבונים. מהפליטה הסופית, הוציאו את הדגימות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח DNA וחלבונים. יתר על כן, לקחת דגימות מן החרוזים שיורית.התחל את Elution denaturation על ידי שטיפת חרוזים מגנטיים פעמיים ב 750 מיקרוליטר של חיץ אמוניום קרבונט קר במשך 20 דקות כל אחד, ארבע מעלות צלזיוס מסתובב ב 20 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של הידרוקסיד אמוניום מולרי 0.5 לחרוזים כדי לחלץ קומפלקסים כרומטין קשור lexA לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מפרידים את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי ומעבירים את הפולט לצינור תגובה בעל קשירה נמוכה.יש לדגור על צינור התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולהפריד את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי. לאחר שתסיים, העבר את הפולט לצינור תגובה מחייב נמוך. להשהות מחדש את החרוזים ב 750 מיקרוליטר של מים deionized ולאסוף דגימות עבור ניתוח DNA וחלבונים.לבסוף, קבל דגימות ניתוח DNA וחלבון מן eluate הסופי. במחקר כומתה יעילות הטיהור של מוקד ARS316 וזן הרקומבינציה והושוותה למוקד הבקרה PDC1. מוקד ARS316 הראה התאוששות נמוכה יותר בזרימה בהשוואה ל- PDC1.למרות שחלק קטן של טבעות הכרומטין נותרו קשורות לחרוזי TEV עקב מחשוף פרוטאז TEV לא שלם, אלוציית דנטורציה הביאה להתאוששות מוקד ARS316 של 80% עד 90%. זה מתאים להעשרה הגבוהה של מולקולות ARS316 בחרוזי TEV ובשברי אלוציה של דנטורציה כאשר משקללים את גודל גנום השמרים בהשוואה לזן הבקרה שלא הראה העשרה של מוקד ARS316 באף אחד מהשברים המכומתים. לאחר הדבקת TEV, החרוזים הראו אחוז התאוששות גבוה יותר של מוקד ARS316 מכיוון שיעילות מחשוף ה- TEV לא הייתה 100%זה הביא לכך שחלק קטן של טבעות הכרומטין נותרו קשורות לחרוזים.עם זאת, החמקמק הדנטורינג הראה התאוששות של 80 עד 90% של מוקד ARS316 וזן הרקומינוס המתאים להעשרה הגבוהה של מולקולות ARS316 כאשר משקללים את גודל גנום השמרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...