migration assay of murine adipose-derived mesenchymal stromal cells

טיפוח AdMSCs וגליה להפחתת דלקת הנגרמת על ידי פריונים

Glial inflammation plays a key role in a variety of neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and prion disease. Although abnormal protein aggregation is attributed to much of disease pathogenesis and neurodegeneration, glial cells also play a part in exacerbating this 1,2,3. Therefore, targeting glial-induced inflammation is a promising therapeutic approach. In prion disease, the cellular prion protein (PrPC) misfolds to the disease-associated prion protein (PrPSc), which forms oligomers and aggregates and disrupts homeostasis in the brain 4,5,6.
One of the earliest signs of prion disease is an inflammatory response from astrocytes and microglia. Studies suppressing this response, either by removal of microglia or modification of astrocytes, have generally shown no improvement on, or worsened, disease pathogenesis in animal models 7,8,9. Modulating glial inflammation without eliminating it is an intriguing alternative as a therapeutic.
Mesenchymal stromal cells (MSCs) have taken the stage as a treatment for a variety of inflammatory diseases, due to their ability to modulate inflammation in a paracrine manner 10,11. They have shown the ability to migrate to sites of inflammation and respond to signaling molecules in these environments by secreting anti-inflammatory molecules, growth factors, microRNAs, and more 10,12,13. We have previously demonstrated that MSCs derived from adipose tissue (denoted AdMSCs) are able to migrate toward prion-infected brain homogenate and respond to this brain homogenate by upregulating gene expression for anti-inflammatory cytokines and growth factors.
Moreover, AdMSCs can decrease the expression of genes associated with Nuclear Factor-kappa B (NF-&#954;B), the Nod-Like Receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasome signaling, and glial activation, in both BV2 microglia and primary mixed glia 14. Here, we provide protocols on how to isolate both AdMSCs and primary mixed glia from mice, stimulate AdMSCs to upregulate modulatory genes, assess AdMSC migration, and co-culture AdMSCs with prion-infected glia. We hope that these procedures can provide a foundation for further investigation of the role of MSCs in regulating glial-induced inflammation in neurodegenerative and other diseases.

מחבר זרקור: תובנה על התקדמות במחקר מחלות פריון

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

Our work focuses on prion diseases, which are fatal neurodegenerative diseases caused by the misfolding of the prion protein in the brain. Few studies have focused on the impact of glial cells on neuronal death. We want to understand if halting inflammation caused by glial cells can be a therapeutic approach.There has been a recent discovery in the mesenchymal stromal cell field, revealing that the protective properties stem from the extracellular vesicles they release. We aim to delve deeper into the contents of these vesicles and understand how they provide protection against prion-induced glial inflammation. Currently in the field of neurodegeneration, there are a few avenues that are successful at halting neuroinflammation.These include small molecules and genetic modulation using adeno or lentiviruses. However, none have been able to fully reduce inflammation, specifically in large areas of the brain. The most significant finding that we have been able to establish is that through cell therapy, we are able to slow prion-disease progression through inhibition of glial inflammation.The use of a combined with the primary glial-cell model of disease will allow us to continue to ask about cellular stress pathways important in neuroprotection, in a more efficient and direct matter than the use of solely in-vivo models.

בדיקת הגירה של תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מורין

יש לטפל בשני AdMSCs עם מדיה המכילה 10 ננוגרם למיליליטר TNF אלפא למשך 24 שעות או ללא TNF אלפא עבור תאים לא מגורים. לאחר שטיפה ודגירת התאים במדיה ללא סרום במשך ארבע שעות, להוסיף 25, 000 AdMSCs לכל עלון לדגור במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לשאוף את התוכן של שניהם היטב ולהכניס, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS משאיר מיליליטר אחד של PBS בכל באר.בעזרת מלקחיים, הסירו את התוספות בזו אחר זו ונגבו בעדינות אך ביסודיות את החדר העליון עם צמר גפן כדי להסיר תאים שלא נדדו. שואפים את ה- PBS והפיפטה הנותרים 500 מיקרוליטר של תמיסה סגולה קריסטלית לבאר ולתא העליון של האינספק. שאפו את התמיסה הסגולה הקריסטלית מהבאר ומהחדר העליון של האינסרט לאחר דגירה של שעה.לאחר שטיפה וניגוב החדר העליון, מניחים את האינסרט בצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של PBS. באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מצלמה, צלם ארבעה אזורים אקראיים לכיוון מרכז הכנס תחת מטרה של פי 10. העלה את התמונות לתוכנת עיבוד התמונה המועדפת והתאם את הרקע לקבלת ניגודיות משופרת עם תאים מוכתמים בסגול.CLIA נגוע ב-22L הראה ביטוי מוגבר של mRNA עבור סמנים דלקתיים CCL2, CCL5 ו-IL1 beta, וסמן האסטרוציטים S100 beta בהשוואה לאלו שטופלו ב-NBH. שיתוף פעולה עם AdMSCs הפחית את הביטוי של הציטוקינים הדלקתיים CCL2, CCL5 ו-IL1 beta, אך לא TNF alpha עבור תאים נגועים ב-MBH ו-22L. BV2s בתרבית משותפת עם AdMSCs הראו ירידה ב-mRNA עבור הסמנים הדלקתיים IL1 beta, IL-6, TNF alpha והחלבון המשלים C1qa הן בתאים שטופלו ב-NBH והן ב-RML.בנוסף, AdMSCs הפחיתו את הגן M1 מיקרוגליה CD16 והגדילו את סמן מיקרוגליה M2 ARG-1. בדיקת ההגירה במבחנה הצביעה על כך ש- AdMSCs הראו הגירה משמעותית לכיוון מדיה המכילה 1% RML.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Migration Assay of Murine Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Isolating and Infecting Primary Cortical Mixed Glia with Prions

בידוד והדבקת גליה מעורבת קליפתית ראשונית עם פריונים