للبدء ، ضع الجرذ المقتل رحيما على سطح التشريح مع الجانب البطني لأعلى. قرصة طبقة الجلد مع ملقط معقم وإجراء تخفيضات على مستوى السطح ، وتجنب الأضرار التي لحقت الأعضاء الداخلية. باستخدام مقص تشريح حاد كبير ، قم بعمل قطع طولي لمستوى السطح في وسط البطن.
ثم انطلاقا من هذا القطع ، قم بعمل قطعتين أفقيتين أقصر واحدة على كل جانب. باستخدام ملقط ، قشر الجلد بعيدا لفضح تجويف البطن. قطع الغشاء البريتوني لفضح الأعضاء الداخلية بالكامل في تجويف البطن مع سهولة الوصول إلى الأمعاء.
باستخدام المقص والملقط ، حدد موقع المعدة وحدد الاثني عشر ، الذي يتراوح طوله بين سنتيمترين وثلاثة سنتيمترات تقريبا والذي يظهر كقطعة صفراء. يقع الصائم القريب حوالي أربعة إلى خمسة سنتيمترات بعيدة عن رباط تريتز. معلم بين الاثني عشر والصائم.
ضع الجزء المعوي المعزول في طبق بتري 10 سم. اغسل الجزء المعوي المطلوب من المساريق ب 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد حتى يتم تطهيره من محتويات اللمعة. على منشفة ورقية ، قطع الجزء المعوي إلى قطعتين طويلتين.
ثم افتح كل قطعة معوية طوليا لفضح الظهارة. اكشط سطح اللمعان المكشوف باستخدام شريحة مجهر زجاجي لإزالة الزغب. ضع القطع المعوية في محلول EDTA على الثلج وقم بتدويره أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على مسدس أنبوبي مضبوط على 10 دورات في الدقيقة.
في المجهر التشريحي ، صب محتويات الأنبوب في طبق بتري 10 سم. أضف خمسة ملليلتر إضافية من برنامج تلفزيوني بارد مثلج. باستخدام ملقط دقيق ، أمسك شريحة معوية واهتز بقوة لمراقبة إطلاق الظهارة في برنامج تلفزيوني.
في البداية ، سيحتوي برنامج تلفزيوني في الغالب على الزغب. هز شظايا الأمعاء بشكل مستمر ، وتجاهل بشكل دوري PBS التي تحتوي على الزغب ، وإضافة 10 ملليلتر من PBS الطازجة إلى شظايا الأمعاء. استمر في هز الشظايا وكرر خطوة غسيل PBS حتى لا يتم إطلاق الزغب في PBS.
ولكن بدلا من ذلك ، يحتوي PBS بشكل أساسي على خبايا. تجاهل الشظايا المعوية المتبقية وإثراء PBS المتبقية في طبق بتري للخبايا المعوية. في غطاء زراعة الأنسجة ، اجمع PBS الذي يحتوي على خبايا وقم بالتصفية من خلال مجفف خلايا 70 ميكرون.
أجهزة الطرد المركزي المرشح في 250 × غرام لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية الخاصة بهم وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليمترات من DMEM plus المتقدم. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 × ز لمدة خمس دقائق.
وإزالة طاف ، وترك 50 ميكرولتر من الوسائط مع بيليه. أعد تعليق الحبيبات في الوسائط المتبقية وأضفها إلى حصصة مستخلص المصفوفة خارج الخلية أو EME على الجليد. قم بالسحب برفق لأعلى ولأسفل لتعليق الخبايا بالتساوي في جميع أنحاء EME لتجنب صنع الفقاعات.
ضع 50 ميكرولترا من قباب EME في طبق زراعة الأنسجة 35 ملم. حضنت 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف ملليلتر من الوسائط العضوية المعوية للفئران ، أو RIOM ، التي تحتوي على 10 ميكرومولار لكل من Y27632 و CHIR99021.
بعد ذلك ، لمرور الكائنات العضوية المعوية للفئران ، قم باستنشاق الوسط من صفيحة تحتوي على مواد عضوية وأضف ملليلتر واحد من كاشف التفكك لتحرير المواد العضوية من قباب EMA. نقل كاشف التفكك مع عضويات مجزأة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. اغسل صفيحة الاستزراع بملليلتر من DMEM plus المتقدم وأضفه إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر الذي يحتوي على المواد العضوية المجزأة.
باستخدام ماصة المراعي الزجاجية ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل 15 إلى 20 مرة لتفتيت المواد العضوية. أجهزة الطرد المركزي المواد العضوية عند 350 × جم لمدة دقيقتين وإضافة 50 ميكرولترا من المحلول من أسفل الأنبوب إلى EME. بعد خلط المحلول ، يتم وضع 50 ميكرولترا من قباب EME في طبق زراعة الأنسجة 35 ملم واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة.
بعد الحضانة ، أضف ملليلتر من RIOM يحتوي على 10 ميكرومولار لكل من Y27632 و CHIR99021. يتم عرض صور تمثيلية لشظايا الزغابات والخبايا. الخبايا أصغر حجما مقارنة بالزغب.
تتوسع الخبايا المطلية خلال الأيام القليلة المقبلة وتبدأ في التبرعم والتمايز بحلول الأيام من أربعة إلى سبعة. بعد يومين من ذوبان الجليد ، أظهرت ثقافة عضوية صحية وجود كل من الكائنات الكروية والمواد العضوية البراعم. أظهر نفس الخط العضوي بعد المرور وجود مجالات واحدة تشبه التشفير.
