首先，将安乐死的大鼠放在解剖表面上，腹面朝上。用无菌镊子捏住皮肤层，并在表面进行切割，避免损伤内脏器官。使用锋利的大解剖剪刀，在腹部中央进行纵向表面水平切割。
然后从该切口开始，进行两个较短的水平切口，每侧一个。使用镊子将皮肤剥离，露出腹腔。切开腹膜，使腹腔内的内脏器官完全暴露，并随时进入肠道。
使用剪刀和镊子，找到胃并识别十二指肠，十二指肠远端约两到三厘米，呈淡黄色部分。空肠近端位于 Treitz 韧带远端约 4 至 5 厘米处。十二指肠和空肠之间的地标。
将分离的肠碎片放入10厘米的培养皿中。用 10 毫升冰冷的 PBS 冲洗所需的肠系膜肠段，直到清除管腔内容物。在纸巾上，将肠段切成两厘米长的块。
然后纵向打开每个肠块，露出上皮。使用玻璃显微镜载玻片刮擦暴露的管腔表面以去除绒毛。将肠块放入冰上的EDTA溶液中，并在设置为10 RPM的管式左轮手枪上旋转4摄氏度30分钟。
在解剖显微镜下，将管的内容物倒入10厘米的培养皿中。再加入五毫升冰冷的PBS。使用细镊子，握住肠段并用力摇晃以观察上皮释放到PBS中。
最初，PBS 将主要包含绒毛。连续摇晃肠道碎片，定期丢弃含有绒毛的PBS，并在肠道碎片中加入10毫升新鲜PBS。继续摇动碎片并重复PBS洗涤步骤，直到绒毛不再释放到PBS中。
但相反，PBS 主要包含隐窝。弃去剩余的肠道碎片，并在培养皿中富集剩余的PBS，用于肠隐窝。在组织培养罩中，收集含有隐窝的PBS并通过70微米细胞引流器过滤。
将滤液以250×g离心5分钟。然后除去其上清液，将沉淀重悬于5毫米的高级DMEM plus中。再次以250×g离心5分钟。
并除去上清液，留下50微升的培养基和沉淀。将沉淀重悬于剩余培养基中，并将其添加到细胞外基质提取物或冰上的EME的等分试样中。轻轻地上下移液，使隐窝均匀地悬挂在整个EME中，避免产生气泡。
将 50 微升 EME 圆顶放入 35 毫米组织培养皿中。在 37 摄氏度的温度下用 5% 的二氧化碳孵育 20 分钟。孵育后，加入两毫升大鼠肠道类器官培养基或RIOM，其中含有Y27632和CHIR99021各10微摩尔。
接下来，要传代大鼠肠道类器官，从含有类器官的平板中吸出培养基，并加入一毫升解离试剂以从 EME 圆顶中释放类器官。将带有片段化类器官的解离试剂转移到 15 毫升锥形管中。用两毫升高级DMEM plus洗涤培养板，并将其添加到含有碎片化类器官的15毫升锥形管中。
使用玻璃牧场移液管，轻轻上下移液 15 至 20 次以碎裂类器官。将类器官以 350 x g 离心 2 分钟，并将 50 微升溶液从管底部加入 EME。混合溶液后，将 50 微升 EME 圆顶板到 35 毫米的组织培养皿中，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育 20 分钟。
孵育后，加入两毫升含有 10 微摩尔的 Y27632 和 CHIR99021 的 RIOM。显示了绒毛碎片和隐窝的代表性图像。与绒毛相比，隐窝的尺寸更小。
在接下来的几天里，镀层隐窝会扩大，并在第四到第七天开始发芽和分化。解冻两天后，健康的类器官培养物显示存在球状体和出芽类器官。传代后的同一类器官系显示存在单个隐窝样结构域。
