Til at begynde med skal du placere den aflivede rotte på dissektionsoverfladen med den ventrale side opad. Klem hudlaget med sterile tang og lav nedskæringer på overfladeniveau, undgå skade på indre organer. Brug en stor skarp dissektionssaks til at skære et langsgående overfladeniveau i midten af maven.
Derefter stammer det fra dette snit, lav to kortere vandrette snit, et på hver side. Brug tang til at skrælle huden væk for at udsætte bughulen. Skær gennem peritonealmembranen for fuldt ud at udsætte de indre organer i bukhulen med let adgang til tarmen.
Brug saks og tang til at lokalisere maven og identificere tolvfingertarmen, cirka to til tre centimeter distal til den, der fremstår som et gulligt segment. Den proksimale jejunum er placeret cirka fire til fem centimeter distal til ledbåndet i Treitz. Et vartegn mellem tolvfingertarmen og jejunum.
Placer det isolerede tarmfragment i en 10 centimeter petriskål. Skyl det ønskede tarmsegment af mesenteri med 10 ml iskold PBS, indtil det er ryddet for luminalt indhold. På et papirhåndklæde skæres tarmsegmentet i to centimeter lange stykker.
Åbn derefter hvert tarmstykke i længderetningen for at udsætte epitelet. Skrab den udsatte luminale overflade ved hjælp af et glasmikroskopglas for at fjerne villi. Placer tarmstykkerne i EDTA-opløsningen på is og drej den fire grader Celsius i 30 minutter på en rørrevolver, der er indstillet til 10 RPM.
Ved dissekeringsmikroskopet hældes indholdet af røret i en 10 centimeter petriskål. Tilsæt yderligere fem milliliter iskold PBS. Brug fine tang, hold et tarmsegment og ryst kraftigt for at observere epitelfrigivelsen i PBS.
I første omgang vil PBS indeholde for det meste villi. Ryst tarmfragmenterne kontinuerligt, kassér regelmæssigt PBS indeholdende villi, og tilsæt 10 ml frisk PBS til tarmfragmenterne. Fortsæt med at ryste fragmenterne, og gentag PBS-vasketrinnet, indtil villi ikke længere frigives i PBS.
Men i stedet indeholder PBS primært krypter. Kassér de resterende tarmfragmenter og berig den resterende PBS i petriskålen til tarmkrypter. I en vævskulturhætte skal du samle PBS indeholdende krypter og filtrere gennem en 70 mikron celledræner.
Filtratet centrifugeres ved 250 x g i fem minutter. Derefter fjernes deres supernatant, og pelleten resuspenderes i fem millimeter avanceret DMEM plus. Der centrifugeres igen ved 250 x g i fem minutter.
Og fjern supernatanten, og lad 50 mikroliter medier være sammen med pelleten. Resuspender pellet i det resterende medie og tilsæt det til alikvoten af det ekstracellulære matrixekstrakt eller EME på is. Pipet forsigtigt op og ned for at suspendere krypterne jævnt i hele EME og undgå at lave bobler.
Anbring 50 mikroliter EME-kupler i en 35 millimeter vævskulturskål. En inkuberet 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 20 minutter. Efter inkubation tilsættes to ml rotte intestinal organoid media eller RIOM, der indeholder 10 mikromolære hver af Y27632 og CHIR99021.
Dernæst for at passere rotte intestinale organoider, aspirer mediet fra en plade indeholdende organoider og tilsæt en milliliter dissociationsreagens for at frigive organoiderne fra EME-kuplerne. Overfør dissociationsreagenset med fragmenterede organoider til et 15 ml konisk rør. Vask kulturpladen med to ml avanceret DMEM plus og tilsæt den til det 15 ml koniske rør, der indeholder de fragmenterede organoider.
Brug en glasgræspipette til forsigtigt at pipette op og ned 15 til 20 gange for at fragmentere organoiderne. Centrifuger organoiderne ved 350 x g i to minutter og tilsæt 50 mikroliter opløsning fra bunden af røret ind i EME. Efter blanding af opløsningen plades 50 mikroliter EME-kupler i en 35 millimeter vævskulturskål og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 20 minutter.
Efter inkubation tilsættes to ml RIOM indeholdende 10 mikromolære hver af Y27632 og CHIR99021. Repræsentative billeder af villi fragmenter og krypter vises. Krypter er mindre i størrelse sammenlignet med villi.
Belagte krypter udvider sig i løbet af de næste par dage og begynder at knoppe og differentiere efter dag fire til syv. Efter to dages optøning viste en sund organoidkultur tilstedeværelsen af både sfæroider og spirende organoider. Den samme organoidlinje efter passaging viste tilstedeværelsen af enkelte kryptlignende domæner.
