Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde rat op het dissectieoppervlak met de buikzijde naar boven. Knijp in de huidlaag met een steriele tang en maak sneden aan de oppervlakte, om schade aan inwendige organen te voorkomen. Maak met een grote scherpe dissectieschaar een snede in de lengterichting in het midden van de buik.
Maak vervolgens, voortkomend uit die snede, twee kortere horizontale sneden, één aan elke kant. Trek met een pincet de huid weg om de buikholte bloot te leggen. Snijd door het peritoneale membraan om de inwendige organen in de buikholte volledig bloot te leggen met gemakkelijke toegang tot de darm.
Gebruik een schaar en een tang om de maag te lokaliseren en de twaalfvingerige darm te identificeren, ongeveer twee tot drie centimeter distaal ervan, die verschijnt als een geelachtig segment. Het proximale jejunum bevindt zich ongeveer vier tot vijf centimeter distaal van het ligament van Treitz. Een herkenningspunt tussen de twaalfvingerige darm en het jejunum.
Plaats het geïsoleerde darmfragment in een petrischaal van 10 centimeter. Spoel het gewenste darmsegment van het mesenterium met 10 milliliter ijskoude PBS totdat het is ontdaan van de luminale inhoud. Snijd het darmsegment op keukenpapier in stukken van twee centimeter lang.
Open vervolgens elk darmstuk in de lengterichting om het epitheel bloot te leggen. Schraap het blootgestelde luminale oppervlak met behulp van een glazen microscoopglaasje om villi te verwijderen. Plaats de darmstukjes in de EDTA-oplossing op ijs en draai deze gedurende 30 minuten vier graden Celsius op een buisrevolver die is ingesteld op 10 RPM.
Giet bij de ontleedmicroscoop de inhoud van de buis in een petrischaaltje van 10 centimeter. Voeg nog eens vijf milliliter ijskoude PBS toe. Houd met een fijne pincet een darmsegment vast en schud krachtig om te zien hoe het epitheel in de PBS terechtkomt.
In eerste instantie zal de PBS voornamelijk villi bevatten. Schud de darmfragmenten continu, gooi de PBS-bevattende villi regelmatig weg en voeg 10 milliliter verse PBS toe aan de darmfragmenten. Blijf de fragmenten schudden en herhaal de PBS-wasstap totdat er geen villi meer vrijkomen in de PBS.
Maar in plaats daarvan bevat de PBS voornamelijk crypten. Gooi de resterende darmfragmenten weg en verrijk de resterende PBS in de petrischaal voor darmcrypten. Verzamel in een weefselkweekkap de PBS-crypten en filtreer door een 70 micron cellendrainer.
Centrifugeer het filtraat gedurende vijf minuten op 250 x g. Verwijder vervolgens hun supernatans en resuspendeer de pellet in vijf millimeter geavanceerde DMEM plus. Centrifugeer opnieuw op 250 x g gedurende vijf minuten.
En verwijder het supernatant en laat 50 microliter media achter bij de pellet. Resuspendeer de pellet in de resterende media en voeg deze toe aan de aliquot van het extracellulaire matrixextract of EME op ijs. Piped voorzichtig op en neer om de crypten gelijkmatig door de EME te laten hangen en te voorkomen dat er bellen ontstaan.
Plaats 50 microliter van de EME-domes in een weefselkweekschaal van 35 millimeter. Een geïncubeerde 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 20 minuten. Voeg na incubatie een twee milliliter rat intestinal organoid media, of RIOM, toe, met elk 10 micromolaar Y27632 en CHIR99021.
Om vervolgens darmorganoïden van ratten te passeren, zuigt u het medium op van een plaat met organoïden en voegt u een milliliter dissociatiereagens toe om de organoïden uit de EME-koepels vrij te maken. Breng het dissociatiereagens met gefragmenteerde organoïden over in een conische buis van 15 milliliter. Was de kweekplaat met twee milliliter geavanceerde DMEM plus en voeg deze toe aan de conische buis van 15 milliliter met de gefragmenteerde organoïden.
Gebruik een glazen weidepipet om voorzichtig 15 tot 20 keer op en neer te pipetteren om de organoïden te fragmenteren. Centrifugeer de organoïden gedurende twee minuten op 350 x g en voeg 50 microliter oplossing van de bodem van de buis toe aan de EME. Na het mengen van de oplossing, plaats 50 microliter van de EME-koepels in een weefselkweekschaal van 35 millimeter en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 20 minuten.
Voeg na incubatie twee milliliter RIOM toe met elk 10 micromolaar Y27632 en CHIR99021. Er worden representatieve afbeeldingen van villi-fragmenten en crypten getoond. Crypten zijn kleiner in vergelijking met villi.
Vergulde crypten breiden zich de komende dagen uit en beginnen te ontluiken en te differentiëren op dag vier tot zeven. Na twee dagen ontdooien toonde een gezonde organoïdencultuur de aanwezigheid van zowel sferoïden als ontluikende organoïden. Dezelfde organoïdelijn na passaging toonde de aanwezigheid van enkele crypte-achtige domeinen.
