Pour commencer, placez le rat euthanasié sur la surface de dissection avec le côté ventral vers le haut. Pincez la couche de peau avec une pince stérile et faites des incisions au niveau de la surface, en évitant d’endommager les organes internes. À l’aide de grands ciseaux de dissection bien aiguisés, faites une incision longitudinale au niveau de la surface au centre de l’abdomen.
Ensuite, à partir de cette coupe, faites deux coupes horizontales plus courtes, une de chaque côté. À l’aide d’une pince, décollez la peau pour exposer la cavité abdominale. Coupez à travers la membrane péritonéale pour exposer complètement les organes internes de la cavité abdominale avec un accès facile à l’intestin.
À l’aide de ciseaux et de pinces, localisez l’estomac et identifiez le duodénum, à environ deux à trois centimètres distal de celui-ci, qui apparaît comme un segment jaunâtre. Le jéjunum proximal est situé à environ quatre à cinq centimètres distaux du ligament de Treitz. Un point de repère entre le duodénum et le jéjunum.
Placez le fragment intestinal isolé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Rincez le segment intestinal souhaité du mésentère avec 10 millilitres de PBS glacé jusqu’à ce qu’il soit débarrassé du contenu luminal. Sur une serviette en papier, coupez le segment intestinal en morceaux de deux centimètres de long.
Ouvrez ensuite chaque morceau intestinal longitudinalement pour exposer l’épithélium. Grattez la surface luminale exposée à l’aide d’une lame de microscope en verre pour enlever les villosités. Placez les morceaux intestinaux dans la solution d’EDTA sur de la glace et faites-les tourner de quatre degrés Celsius pendant 30 minutes sur un revolver à tube réglé sur 10 tr/min.
Au microscope à dissection, versez le contenu du tube dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Ajoutez cinq millilitres supplémentaires de PBS glacé. À l’aide d’une pince fine, tenez un segment intestinal et secouez vigoureusement pour observer la libération de l’épithélium dans le PBS.
Dans un premier temps, le PBS contiendra principalement des villosités. Agitez continuellement les fragments intestinaux, jetez périodiquement les villosités contenant des PBS et ajoutez 10 millilitres de PBS frais aux fragments intestinaux. Continuez à secouer les fragments et répétez l’étape de lavage du PBS jusqu’à ce que les villosités ne soient plus libérées dans le PBS.
Mais au lieu de cela, le PBS contient principalement des cryptes. Jetez les fragments intestinaux restants et enrichissez le PBS restant dans la boîte de Pétri pour les cryptes intestinales. Dans une hotte de culture tissulaire, recueillir le PBS contenant des cryptes et filtrer à travers un draineur de cellules de 70 microns.
Centrifuger le filtrat à 250 x g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez leur surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millimètres de DMEM plus avancé. Centrifuger à nouveau à 250 x g pendant cinq minutes.
Et retirez le surnageant, en laissant 50 microlitres de média avec la pastille. Remettre la pastille en suspension dans le milieu restant et l’ajouter à l’aliquote de l’extrait de matrice extracellulaire ou EME sur glace. Pipetez doucement de haut en bas pour suspendre les cryptes uniformément dans tout l’EME en évitant de faire des bulles.
Placez 50 microlitres de dômes EME dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres. Une température incubée à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes. Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de milieux organoïdes intestinaux de rat, ou RIOM, contenant 10 micromolaires de Y27632 et CHIR99021.
Ensuite, pour faire passer des organoïdes intestinaux de rat, aspirer le milieu d’une plaque contenant des organoïdes et ajouter un millilitre de réactif de dissociation pour libérer les organoïdes des dômes EME. Transférez le réactif de dissociation avec des organoïdes fragmentés dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez la plaque de culture avec deux millilitres de DMEM plus avancé et ajoutez-la au tube conique de 15 millilitres contenant les organoïdes fragmentés.
À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, pipeter doucement de haut en bas 15 à 20 fois pour fragmenter les organoïdes. Centrifugez les organoïdes à 350 x g pendant deux minutes et ajoutez 50 microlitres de solution du fond du tube dans l’EME. Après avoir mélangé la solution, plaquez 50 microlitres de dômes EME dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes.
Après incubation, ajoutez deux millilitres de RIOM contenant 10 micromolaires de Y27632 et CHIR99021. Des images représentatives de fragments de villosités et de cryptes sont présentées. Les cryptes sont de plus petite taille que les villosités.
Les cryptes plaquées s’étendent au cours des jours suivants et commencent à bourgeonner et à se différencier du quatrième au septième jour. Après deux jours de décongélation, une culture d’organoïdes sains a montré la présence à la fois de sphéroïdes et d’organoïdes bourgeonnés. La même lignée organoïde après le passage a montré la présence de domaines uniques de type crypte.
