כדי להתחיל, הניחו את החולדה המורדמת על משטח הדיסקציה כשהצד הגחוני כלפי מעלה. צובטים את שכבת העור במלקחיים סטריליים ומבצעים חתכים בגובה פני השטח, תוך הימנעות מנזק לאיברים פנימיים. באמצעות מספריים גדולים וחדים דיסקציה, לבצע חיתוך פני השטח אורכי במרכז הבטן.
לאחר מכן, כתוצאה מחיתוך זה, בצע שני חתכים אופקיים קצרים יותר, אחד מכל צד. בעזרת מלקחיים, לקלף את העור משם כדי לחשוף את חלל הבטן. לחתוך דרך קרום הצפק כדי לחשוף באופן מלא את האיברים הפנימיים בחלל הבטן עם גישה מוכנה למעי.
בעזרת מספריים ומלקחיים, מאתרים את הקיבה ומזהים את התריסריון, כשניים עד שלושה סנטימטרים דיסטליים אליו המופיע כמקטע צהבהב. הג'ג'ונום הפרוקסימלי ממוקם כארבעה עד חמישה סנטימטרים דיסטליים לרצועה של טרייץ. ציון דרך בין התריסריון לג'ג'ונום.
מניחים את קטע המעי המבודד לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ. יש לשטוף את מקטע המעי הרצוי של מזנטריה עם 10 מיליליטר של PBS קר כקרח עד לניקוי התוכן הלומינלי. על מגבת נייר, לחתוך את קטע המעי לחתיכות באורך שני סנטימטרים.
לאחר מכן לפתוח כל חתיכת מעיים לאורך כדי לחשוף את האפיתל. גרדו את משטח האור החשוף באמצעות מגלשת מיקרוסקופ זכוכית כדי להסיר את הווילי. הניחו את חתיכות המעי בתמיסת EDTA על קרח וסובבו אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על אקדח צינור המכוון ל-10 סל"ד.
במיקרוסקופ המנתחת, יוצקים את תכולת הצינור לתוך צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים. הוסף חמישה מיליליטר נוספים של PBS קר כקרח. באמצעות מלקחיים עדינים, להחזיק קטע מעיים ולנער במרץ כדי לראות את שחרור אפיתל לתוך PBS.
בתחילה, PBS יכיל בעיקר villi. נערו את שברי המעי ברציפות, השליכו מעת לעת את PBS המכיל וילי והוסיפו 10 מיליליטר של PBS טרי לשברי המעי. המשיכו לנער את השברים וחזרו על שלב השטיפה של PBS עד שהווילי לא ישוחרר יותר ל-PBS.
אבל במקום זאת, PBS מכיל בעיקר crypts. השליכו את שברי המעי הנותרים והעשירו את שאריות ה-PBS בצלחת הפטרי עבור קריפטים במעיים. במכסה מנוע של תרבית רקמה, יש לאסוף את ה-PBS המכיל קריפטות ולסנן דרך מנקז תאים של 70 מיקרון.
צנטריפוגה את התסנין ב 250 x גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את supernatant שלהם להשעות מחדש את הגלולה בחמישה מילימטרים של DMEM מתקדם פלוס. צנטריפוגה שוב ב 250 x גרם במשך חמש דקות.
ולהסיר את supernatant, משאיר 50 מיקרוליטר של מדיה עם הכדור. להשעות מחדש את הגלולה במדיה הנותרת ולהוסיף אותו aliquot של תמצית מטריצה תאית או EME על קרח. צינור בעדינות למעלה ולמטה כדי להשעות את הקריפטות באופן שווה ברחבי EME הימנעות יצירת בועות.
מניחים 50 מיקרוליטר של כיפות EME לתוך צלחת תרבית רקמה 35 מילימטר. דגירה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו שני מיליליטר של חומר אורגנואיד מעי של חולדה, או RIOM, המכיל 10 מיקרומולרים כל אחד של Y27632 ו-CHIR99021.
לאחר מכן, כדי לעבור אורגנואידים במעיים של חולדות, שאפו את התווך מצלחת המכילה אורגנואידים והוסיפו מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה כדי לשחרר את האורגנואידים מכיפות ה-EME. העבר את מגיב הדיסוציאציה עם אורגנואידים מקוטעים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. שטפו את צלחת התרבית בשני מיליליטר של DMEM מתקדם פלוס והוסיפו אותה לצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל את האורגנואידים המפוצלים.
בעזרת פיפטה מרעה מזכוכית, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 15 עד 20 פעמים כדי לשבור את האורגנואידים. צנטריפוגות את האורגנואידים ב 350 x גרם במשך שתי דקות ולהוסיף 50 מיקרוליטר של תמיסה מתחתית הצינור לתוך EME. לאחר ערבוב התמיסה, צלחת 50 מיקרוליטר של כיפות EME לתוך צלחת תרבית רקמה 35 מ"מ ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 20 דקות.
לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של RIOM המכילים 10 מיקרומולר כל אחד של Y27632 ו CHIR99021. מוצגות תמונות מייצגות של שברי וילי וקריפטות. קריפטים קטנים יותר בגודלם בהשוואה לווילי.
הקריפטים המצופים מתרחבים במהלך הימים הבאים ומתחילים לנבוט ולהבדיל בימים ארבע עד שבע. לאחר יומיים של הפשרה, תרבית אורגנואידים בריאה הראתה נוכחות של ספרואידים ואורגנואידים ניצנים. אותו קו אורגנואידים לאחר המעבר הראה נוכחות של תחומים דמויי קריפטה בודדים.
