Establishment and Passaging of Small Intestine Organoids

शुरू करने के लिए, इच्छामृत्यु वाले चूहे को उदर पक्ष के साथ विच्छेदन सतह पर रखें। बाँझ बल के साथ त्वचा की परत को पिंच करें और आंतरिक अंगों को नुकसान से बचने के लिए सतह के स्तर पर कटौती करें। बड़ी तेज विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, पेट के केंद्र में एक अनुदैर्ध्य सतह स्तर कट बनाएं।

फिर उस कट से उपजी, प्रत्येक तरफ एक दो छोटे क्षैतिज कट बनाएं। बल का उपयोग करके, पेट की गुहा को उजागर करने के लिए त्वचा को छील दें। आंत तक तैयार पहुंच के साथ पेट की गुहा में आंतरिक अंगों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए पेरिटोनियल झिल्ली के माध्यम से काटें।

कैंची और बल का उपयोग करके, पेट का पता लगाएं और ग्रहणी की पहचान करें, जो लगभग दो से तीन सेंटीमीटर दूर है जो पीले रंग के खंड के रूप में दिखाई देता है। समीपस्थ जेजुनम ट्रेइट्ज़ के लिगामेंट से लगभग चार से पांच सेंटीमीटर दूर स्थित है। ग्रहणी और जेजुनम के बीच एक मील का पत्थर।

पृथक आंतों के टुकड़े को 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में रखें। मेसेन्ट्री के वांछित आंतों के खंड को 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ फ्लश करें जब तक कि ल्यूमिनल सामग्री साफ न हो जाए। एक पेपर टॉवल पर, आंतों के खंड को दो सेंटीमीटर लंबे टुकड़ों में काट लें।

फिर एपिथेलियम को उजागर करने के लिए प्रत्येक आंतों के टुकड़े को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें। विली को हटाने के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके उजागर ल्यूमिनल सतह को खुरचें। आंतों के टुकड़ों को बर्फ पर ईडीटीए समाधान में रखें और इसे 10 आरपीएम पर सेट ट्यूब रिवॉल्वर पर 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस घुमाएं।

विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर, ट्यूब की सामग्री को 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में डालें। अतिरिक्त पांच मिलीलीटर बर्फ ठंडा पीबीएस जोड़ें। बारीक बल का उपयोग करके, आंतों के खंड को पकड़ें और पीबीएस में एपिथेलियम रिलीज का निरीक्षण करने के लिए जोर से हिलाएं।

प्रारंभ में, पीबीएस में ज्यादातर विली शामिल होंगे। आंतों के टुकड़ों को लगातार हिलाएं, समय-समय पर विली युक्त पीबीएस को छोड़ दें, और आंतों के टुकड़ों में 10 मिलीलीटर ताजा पीबीएस जोड़ें। टुकड़ों को हिलाना जारी रखें और पीबीएस धोने के चरण को दोहराएं जब तक कि विली अब पीबीएस में जारी नहीं किया जाता है।

लेकिन इसके बजाय, पीबीएस में मुख्य रूप से क्रिप्ट शामिल हैं। शेष आंतों के टुकड़ों को त्याग दें और आंतों के क्रिप्ट के लिए पेट्री डिश में शेष पीबीएस को समृद्ध करें। एक ऊतक संस्कृति हुड में, क्रिप्ट्स युक्त पीबीएस एकत्र करें और 70 माइक्रोन कोशिकाओं के ड्रेनर के माध्यम से फ़िल्टर करें।

पांच मिनट के लिए 250 x g पर छानना सेंट्रीफ्यूज करें। फिर उनके सुपरनैटेंट को हटा दें और उन्नत डीएमईएम प्लस के पांच मिलीमीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज फिर से पांच मिनट के लिए 250 x g पर करें।

और सतह पर तैरने वाले को हटा दें, गोली के साथ 50 माइक्रोलीटर मीडिया छोड़ दें। शेष मीडिया में गोली को पुन: निलंबित करें और इसे बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स अर्क या ईएमई के एलिकोट में जोड़ें। बुलबुले बनाने से बचने के लिए पूरे ईएमई में क्रिप्ट को समान रूप से निलंबित करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करें।

ईएमई गुंबद के 50 माइक्रोलीटर को 35 मिलीमीटर ऊतक संस्कृति डिश में रखें। 20 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, दो मिलीलीटर चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड मीडिया, या आरआईओएम को जोड़ें, जिसमें वाई 27632 और CHIR99021 के 10 माइक्रोमोलर शामिल हैं।

इसके बाद, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स को पारित करने के लिए, ऑर्गेनोइड्स युक्त प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें और ईएमई गुंबदों से ऑर्गेनोइड्स को छोड़ने के लिए एक मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें। खंडित ऑर्गेनोइड्स के साथ पृथक्करण अभिकर्मक को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कल्चर प्लेट को दो मिलीलीटर उन्नत डीएमईएम प्लस के साथ धोएं और इसे खंडित ऑर्गेनोइड्स युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें।

एक ग्लास चरागाह पिपेट का उपयोग करके, ऑर्गेनोइड्स को टुकड़े करने के लिए धीरे से 15 से 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। दो मिनट के लिए 350 x g पर ऑर्गेनोइड ्स को सेंट्रीफ्यूज करें और ट्यूब के नीचे से ईएमई में 50 माइक्रोलीटर घोल जोड़ें। घोल को मिलाने के बाद, ईएमई गुंबद के प्लेट 50 माइक्रोलीटर को 35 मिलीमीटर टिशू कल्चर डिश में डालें और 20 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

इनक्यूबेशन के बाद, दो मिलीलीटर रियोम जोड़ें जिसमें वाई 27632 और CHIR99021 के 10 माइक्रोमोलर हों। विली टुकड़ों और क्रिप्ट्स की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। विली की तुलना में क्रिप्ट आकार में छोटे होते हैं।

प्लेटेड क्रिप्ट्स अगले कुछ दिनों में फैलते हैं और चार से सात दिनों तक बढ़ने लगते हैं। पिघलने के दो दिनों के बाद, एक स्वस्थ ऑर्गेनॉइड संस्कृति ने स्फेरॉइड और बुडेड ऑर्गेनोइड दोनों की उपस्थिति दिखाई। पासिंग के बाद एक ही ऑर्गनॉइड लाइन ने एकल क्रिप्ट-जैसे डोमेन की उपस्थिति दिखाई।