Per iniziare, posiziona il ratto soppresso sulla superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Pizzicare lo strato cutaneo con una pinza sterile e praticare tagli a livello superficiale, evitando danni agli organi interni. Usando grandi forbici da dissezione affilate, eseguire un taglio longitudinale a livello della superficie al centro dell'addome.
Quindi, partendo da quel taglio, fai due tagli orizzontali più corti, uno su ciascun lato. Usando una pinza, staccare la pelle per esporre la cavità addominale. Tagliare la membrana peritoneale per esporre completamente gli organi interni nella cavità addominale con un facile accesso all'intestino.
Usando forbici e pinze, individua lo stomaco e identifica il duodeno, a circa due o tre centimetri distale da esso, che appare come un segmento giallastro. Il digiuno prossimale si trova a circa quattro o cinque centimetri distale dal legamento di Treitz. Un punto di riferimento tra il duodeno e il digiuno.
Mettere il frammento intestinale isolato in una capsula di Petri di 10 centimetri. Sciacquare il segmento intestinale desiderato del mesentere con 10 millilitri di PBS ghiacciato fino a quando non viene eliminato il contenuto luminale. Su un tovagliolo di carta, tagliate il segmento intestinale in pezzi lunghi due centimetri.
Quindi aprire longitudinalmente ogni pezzo intestinale per esporre l'epitelio. Raschiare la superficie luminale esposta utilizzando un vetrino da microscopio per rimuovere i villi. Mettere i pezzi intestinali nella soluzione di EDTA su ghiaccio e ruotarla di quattro gradi Celsius per 30 minuti su un revolver a tubo impostato a 10 giri/min.
Al microscopio da dissezione, versare il contenuto della provetta in una capsula di Petri di 10 centimetri. Aggiungi altri cinque millilitri di PBS ghiacciato. Usando una pinza fine, tenere un segmento intestinale e agitare vigorosamente per osservare il rilascio dell'epitelio nel PBS.
Inizialmente, il PBS conterrà principalmente villi. Agitare continuamente i frammenti intestinali, scartare periodicamente i villi contenenti PBS e aggiungere 10 millilitri di PBS fresco ai frammenti intestinali. Continuare a scuotere i frammenti e ripetere la fase di lavaggio del PBS fino a quando i villi non vengono più rilasciati nel PBS.
Invece, il PBS contiene principalmente cripte. Scartare i frammenti intestinali rimanenti e arricchire il PBS rimanente nella capsula di Petri per le cripte intestinali. In una cappa per coltura tissutale, raccogliere il PBS contenente cripte e filtrare attraverso uno scolatore di cellule da 70 micron.
Centrifugare il filtrato a 250 x g per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in cinque millimetri di DMEM plus avanzato. Centrifugare di nuovo a 250 x g per cinque minuti.
E rimuovere il surnatante, lasciando 50 microlitri di terreno con il pellet. Risospendere il pellet nel terreno rimanente e aggiungerlo all'aliquota dell'estratto di matrice extracellulare o EME su ghiaccio. Pipettare delicatamente su e giù per sospendere le cripte in modo uniforme in tutto l'EME evitando di formare bolle.
Mettere 50 microlitri delle cupole EME in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri. Un'incubazione a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di terreno organoide intestinale di ratto, o RIOM, contenente 10 micromolari ciascuno di Y27632 e CHIR99021.
Successivamente, per passare gli organoidi intestinali di ratto, aspirare il terreno da una piastra contenente organoidi e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione per rilasciare gli organoidi dalle cupole EME. Trasferire il reagente di dissociazione con organoidi frammentati in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare la piastra di coltura con due millilitri di DMEM plus avanzato e aggiungerla alla provetta conica da 15 millilitri contenente gli organoidi frammentati.
Usando una pipetta di vetro per pascolo, pipettare delicatamente su e giù da 15 a 20 volte per frammentare gli organoidi. Centrifugare gli organoidi a 350 x g per due minuti e aggiungere 50 microlitri di soluzione dal fondo della provetta nell'EME. Dopo aver miscelato la soluzione, mettere in piastra 50 microlitri delle cupole EME in un piatto di coltura tissutale da 35 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 20 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di RIOM contenente 10 micromolari ciascuno di Y27632 e CHIR99021. Sono mostrate immagini rappresentative di frammenti di villi e cripte. Le cripte sono di dimensioni più piccole rispetto ai villi.
Le cripte placcate si espandono nei giorni successivi e iniziano a germogliare e differenziarsi dal quarto al settimo giorno. Dopo due giorni di scongelamento, una coltura di organoidi sani ha mostrato la presenza sia di sferoidi che di organoidi germogliati. La stessa linea di organoidi dopo il passaggio ha mostrato la presenza di singoli domini simili a cripte.
