For å begynne, plasser den avlivede rotta på disseksjonsoverflaten med ventralsiden opp. Klem hudlaget med steril tang og gjør kutt på overflatenivå, unngå skade på indre organer. Bruk en skarp disseksjonssaks til å lage et langsgående overflatenivå kuttet i midten av magen.
Deretter stammer fra det kuttet, gjør to kortere horisontale kutt en på hver side. Bruk tang, skrell huden bort for å eksponere bukhulen. Klipp gjennom bukhinnen for å fullstendig eksponere de indre organene i bukhulen med klar tilgang til tarmen.
Bruk saks og tang, finn magen og identifiser tolvfingertarmen, omtrent to til tre centimeter distalt for den som ser ut som et gulaktig segment. Den proksimale jejunum ligger omtrent fire til fem centimeter distalt for leddbåndet til Treitz. Et landemerke mellom tolvfingertarmen og jejunum.
Legg det isolerte tarmfragmentet i en 10 centimeter petriskål. Skyll det ønskede tarmsegmentet av mesenteri med 10 ml iskald PBS til det er ryddet av luminalinnhold. På et papirhåndkle, kutt tarmsegmentet i to centimeter lange stykker.
Åpne deretter hvert tarmstykke i lengderetningen for å eksponere epitelet. Skrap den eksponerte luminaloverflaten ved hjelp av et glassmikroskopglass for å fjerne villi. Plasser tarmbitene i EDTA-løsningen på is og roter den fire grader Celsius i 30 minutter på en rørrevolver satt til 10 RPM.
Ved dissekeringsmikroskopet, hell innholdet i røret i en 10 centimeter petriskål. Legg i ytterligere fem milliliter iskald PBS. Bruk fine tang, hold et tarmsegment og rist kraftig for å observere epitelfrigjøringen i PBS.
I utgangspunktet vil PBS inneholde det meste villi. Rist tarmfragmentene kontinuerlig, kast regelmessig PBS som inneholder villi, og tilsett 10 ml fersk PBS til tarmfragmentene. Fortsett å riste fragmentene og gjenta PBS-vasketrinnet til villi ikke lenger slippes ut i PBS.
Men i stedet inneholder PBS først og fremst krypter. Kast de resterende tarmfragmentene og berik de resterende PBS i petriskålen for tarmkrypter. I en vevskulturhette, samle PBS som inneholder krypter og filtrer gjennom en 70 mikron celler drainer.
Sentrifuger filtratet ved 250 x g i fem minutter. Fjern deretter supernatanten og resuspender pelleten i fem millimeter avansert DMEM pluss. Sentrifuge igjen ved 250 x g i fem minutter.
Og fjern supernatanten, og etterlater 50 mikroliter media med pelleten. Resuspender pelleten i det gjenværende mediet og tilsett den til alikoten av det ekstracellulære matriksekstraktet eller EME på is. Rør forsiktig opp og ned for å henge kryptene jevnt gjennom EME, slik at du unngår å lage bobler.
Plasser 50 mikroliter av EME-kuplene i en 35 millimeter vevskulturfat. En inkubert 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 20 minutter. Etter inkubering, tilsett en to milliliter rotte intestinal organoid media, eller RIOM, som inneholder 10 mikromolar hver av Y27632 og CHIR99021.
Neste, for å passere rotte tarmorganoider, aspirer mediet fra en plate som inneholder organoider og tilsett en milliliter dissosiasjonsreagens for å frigjøre organoider fra EME-kuplene. Overfør dissosiasjonsreagenset med fragmenterte organoider til et 15 milliliter konisk rør. Vask kulturplaten med to milliliter avansert DMEM pluss og legg den til det 15 milliliter koniske røret som inneholder de fragmenterte organoider.
Bruk en glasspastipette til å pipette forsiktig opp og ned 15 til 20 ganger for å fragmentere organoidene. Sentrifuge organoider ved 350 x g i to minutter og tilsett 50 mikroliter løsning fra bunnen av røret inn i EME. Etter å ha blandet løsningen, plate 50 mikroliter av EME-kuplene i en 35 millimeter vevskulturskål og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 20 minutter.
Etter inkubering, tilsett to milliliter RIOM inneholdende 10 mikromolar hver av Y27632 og CHIR99021. Representative bilder av villi fragmenter og krypter vises. Krypter er mindre i størrelse sammenlignet med villi.
Belagte krypter utvider seg i løpet av de neste dagene og begynner å knoppe og differensiere etter dag fire til syv. Etter to dager med tining viste en sunn organoidkultur tilstedeværelsen av både sfæroider og spireorganoider. Den samme organoide linjen etter passering viste tilstedeværelsen av enkle kryptlignende domener.
