Till att börja med placerar du den avlivade råttan på dissektionsytan med den ventrala sidan uppåt. Nyp ihop hudlagret med en steril pincett och gör snitt på ytnivå, undvik skador på inre organ. Använd en stor vass dissektionssax och gör ett längsgående ytnivåsnitt i mitten av buken.
Gör sedan två kortare horisontella snitt, ett på varje sida. Använd en pincett och dra bort huden för att exponera bukhålan. Skär igenom peritonealmembranet för att helt exponera de inre organen i bukhålan med enkel tillgång till tarmen.
Använd en sax och pincett, lokalisera magsäcken och identifiera tolvfingertarmen, cirka två till tre centimeter distalt om den, som ser ut som ett gulaktigt segment. Det proximala jejunum ligger cirka fyra till fem centimeter distalt om Treitz ligament. Ett landmärke mellan tolvfingertarmen och jejunum.
Lägg det isolerade tarmfragmentet i en 10 centimeter stor petriskål. Spola det önskade tarmsegmentet av mesenteri med 10 milliliter iskall PBS tills det är rensat från luminalt innehåll. Skär tarmsegmentet i två centimeter långa bitar på en pappershandduk.
Öppna sedan varje tarmdel i längdriktningen för att exponera epitelet. Skrapa den exponerade ljusytan med ett glasmikroskopglas för att ta bort villi. Lägg tarmbitarna i EDTA-lösningen på is och rotera den fyra grader Celsius i 30 minuter på en rörrevolver inställd på 10 varv per minut.
Vid dissekeringsmikroskopet häller du rörets innehåll i en 10 centimeter petriskål. Tillsätt ytterligare fem milliliter iskall PBS. Använd en fin pincett, håll ett tarmsegment och skaka kraftigt för att observera epitelet som släpps ut i PBS.
Till en början kommer PBS att innehålla mestadels villi. Skaka tarmfragmenten kontinuerligt, kassera regelbundet PBS som innehåller villi och tillsätt 10 milliliter färsk PBS till tarmfragmenten. Fortsätt att skaka fragmenten och upprepa PBS-tvättsteget tills villi inte längre släpps ut i PBS.
Men istället innehåller PBS främst kryptor. Kassera de återstående tarmfragmenten och berika de återstående PBS:erna i petriskålen för tarmkryptor. I en vävnadsodlingshuva, samla PBS som innehåller kryptor och filtrera genom en 70 mikron celldränerare.
Centrifugera filtratet vid 250 x g i fem minuter. Ta sedan bort deras supernatant och återsuspendera pelleten i fem millimeter avancerad DMEM plus. Centrifugera igen vid 250 x g i fem minuter.
Och ta bort supernatanten och lämna 50 mikroliter media med pelleten. Blanda pelleten på nytt i det återstående mediet och tillsätt den till alikvoten av extraktet av extracellulär matris eller EME på is. Rör försiktigt upp och ner för att hänga upp kryptorna jämnt i hela EME och undvik att skapa bubblor.
Placera 50 mikroliter av EME-kupolerna i en 35 millimeter vävnadsodlingsskål. En inkuberad 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 20 minuter. Efter inkubationen tillsätts två milliliter råtttarmorganoidmedia, eller RIOM, innehållande 10 mikromolar vardera av Y27632 och CHIR99021.
Därefter, för att passera råtttarmorganoider, aspirera mediet från en platta som innehåller organoider och tillsätt en milliliter dissociationsreagens för att frigöra organoiderna från EME-kupolerna. Överför dissociationsreagenset med fragmenterade organoider till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta odlingsplattan med två milliliter avancerad DMEM plus och tillsätt den till det 15 milliliter koniska röret som innehåller de fragmenterade organoiderna.
Använd en pipett av glas och pipettera försiktigt upp och ner 15 till 20 gånger för att fragmentera organoiderna. Centrifugera organoiderna vid 350 x g i två minuter och tillsätt 50 mikroliter lösning från botten av röret till EME. Efter blandning av lösningen, platta 50 mikroliter av EME kupoler i en 35 millimeter vävnadsodlingsskål och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 20 minuter.
Efter inkubationen, tillsätt två milliliter RIOM innehållande 10 mikromolar vardera av Y27632 och CHIR99021. Representativa bilder av villifragment och kryptor visas. Kryptor är mindre i storlek jämfört med villi.
Pläterade kryptor expanderar under de närmaste dagarna och börjar knoppa och differentiera sig under dag fyra till sju. Efter två dagars upptining visade en frisk organoidkultur närvaron av både sfäroider och knoppade organoider. Samma organoidlinje efter passering visade närvaron av enstaka kryptliknande domäner.
