Başlamak için, ötenazi faresini ventral tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon yüzeyine yerleştirin. Cilt tabakasını steril forseps ile sıkıştırın ve iç organlara zarar vermemek için yüzey seviyesinde kesikler yapın. Büyük keskin diseksiyon makası kullanarak, karnın ortasında uzunlamasına bir yüzey seviyesi kesimi yapın.
Daha sonra bu kesimden yola çıkarak, her iki tarafta birer tane olmak üzere iki kısa yatay kesim yapın. Forseps kullanarak, karın boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi soyun. Bağırsaklara hazır erişim ile karın boşluğundaki iç organları tamamen ortaya çıkarmak için periton zarını kesin.
Makas ve forseps kullanarak mideyi bulun ve sarımsı bir segment olarak görünen yaklaşık iki ila üç santimetre distal duodenumu tanımlayın. Proksimal jejunum, Treitz ligamentinin yaklaşık dört ila beş santimetre distalinde bulunur. Duodenum ve jejunum arasında bir dönüm noktası.
İzole edilmiş bağırsak parçasını 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. İstenilen bağırsak mezenter segmentini, lümen içeriğinden temizlenene kadar 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Bir kağıt havlu üzerinde, bağırsak segmentini iki santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin.
Daha sonra epiteli ortaya çıkarmak için her bir bağırsak parçasını uzunlamasına açın. Villusları çıkarmak için bir cam mikroskop lamı kullanarak açıkta kalan lümen yüzeyini kazıyın. Bağırsak parçalarını buz üzerindeki EDTA çözeltisine yerleştirin ve 10 RPM'ye ayarlanmış bir tüp tabanca üzerinde 30 dakika boyunca dört santigrat derece döndürün.
Diseksiyon mikroskobunda, tüpün içeriğini 10 santimetrelik bir Petri kabına dökün. Beş mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. İnce forseps kullanarak, bir bağırsak segmentini tutun ve PBS'ye epitel salınımını gözlemlemek için kuvvetlice sallayın.
Başlangıçta, PBS çoğunlukla villus içerecektir. Bağırsak parçalarını sürekli çalkalayın, villus içeren PBS'yi periyodik olarak atın ve bağırsak parçalarına 10 mililitre taze PBS ekleyin. Parçaları sallamaya devam edin ve villuslar artık PBS'ye salınmayana kadar PBS yıkama adımını tekrarlayın.
Ancak bunun yerine, PBS öncelikle kriptler içerir. Kalan bağırsak parçalarını atın ve kalan PBS'yi Petri kabında bağırsak kriptleri için zenginleştirin. Bir doku kültürü başlığında, kript içeren PBS'yi toplayın ve 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.
Süzüntüyü beş dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantlarını çıkarın ve peleti beş milimetre gelişmiş DMEM plus'ta yeniden süspanse edin. Beş dakika boyunca 250 x g'de tekrar santrifüjleyin.
Ve süpernatanı çıkarın, pelet ile birlikte 50 mikrolitre ortam bırakın. Kalan ortamdaki peleti yeniden süspanse edin ve hücre dışı matris ekstraktının veya buz üzerindeki EME'nin alikotuna ekleyin. Baloncuk yapmaktan kaçınarak kriptleri EME boyunca eşit şekilde asmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
50 mikrolitre EME kubbesini 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin. 20 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra, her biri 10 mikromolar Y27632 ve CHIR99021 içeren iki mililitre sıçan bağırsak organoid ortamı veya RIOM ekleyin.
Daha sonra, sıçan bağırsak organoidlerini geçmek için, ortamı organoidler içeren bir plakadan aspire edin ve organoidleri EME kubbelerinden serbest bırakmak için bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyin. Parçalanmış organoidlerle ayrışma reaktifini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kültür plakasını iki mililitre gelişmiş DMEM plus ile yıkayın ve parçalanmış organoidleri içeren 15 mililitrelik konik tüpe ekleyin.
Bir cam mera pipeti kullanarak, organoidleri parçalamak için 15 ila 20 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Organoidleri iki dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve tüpün altından EME'ye 50 mikrolitre çözelti ekleyin. Çözeltiyi karıştırdıktan sonra, 50 mikrolitre EME kubbesini 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 20 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, her biri 10 mikromolar Y27632 ve CHIR99021 içeren iki mililitre RIOM ekleyin. Villus parçalarının ve kriptlerin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Kriptolar, villuslara kıyasla boyut olarak daha küçüktür.
Kaplama kriptleri önümüzdeki birkaç gün içinde genişler ve dört ila yedi gün arasında tomurcuklanmaya ve farklılaşmaya başlar. İki günlük çözülmeden sonra, sağlıklı bir organoid kültür, hem sferoidlerin hem de tomurcuklanmış organoidlerin varlığını gösterdi. Geçişten sonra aynı organoid çizgi, tek kript benzeri alanların varlığını gösterdi.
