For å belegge platen med EME, fortynn EME 1 til 20 i kaldt Advanced DMEM + For belegg med kollagen, fortynn fem milligram per milliliter kollagen I i avansert DMEM + til 100 mikrogram per milliliter. Belegg med platen med 200 mikroliter fortynnet EME eller kollagen for å dekke brønnoverflaten helt og inkubere i en til to timer ved 37 grader Celsius. For å generere monolayers, aspirer mediet fra en 35 millimeter plate som inneholder organoider.
Tilsett en milliliter PBS og forstyrr EME i brønnene med en P1000-spiss, pipetter opp og ned omtrent 20 ganger for å løsne all EME. Overfør innholdet til et 15 milliliter konisk rør. Legg til en milliliter PBS på platen for å samle flere organoider og overføre dem til samme koniske rør.
Sentrifuger prøven ved 350 G i to minutter og fjern supernatanten, inkludert eventuelle EME-rester. Deretter tilsettes en milliliter trypsinoppløsning til organoidpelleten og inkuberes ved 37 grader Celsius i to minutter. Pipett opp og ned 10 ganger ved hjelp av en P1000-spiss og tilsett to milliliter avansert DMEM + for å nøytralisere trypsin.
Sentrifuge ved 350 G i fem minutter og aspirer supernanten før pelleten resuspenderes i 4,8 milliliter rIOM2D. Fjern overflødig EME eller kollagen i Advanced DMEM+ fra brønnene. Deretter tilsettes 200 mikroliter organoider i rIOM2D og 10 mikromolar Y27632 til hver forhåndsbelagt brønn.
Etter 4 til 16 timer, samle media og sentrifuge ved 1.000 G i ett minutt. Overfør supernatanten til et nytt 15 milliliter konisk rør og kast pelleten. Vask hver brønn med 300 mikroliter PBS før du tilsetter 200 mikroliter av sentrifugert rIOM2D til hver brønn.
Endre rIOM2D hver to til tre dager, suspendere bruken av Y27632.2D monolayers belagt på EME lett reformert til små sfæroider når EME ble lagt tilbake til toppen av cellene. I motsetning til dette var et kollagen I-substrat utilstrekkelig til å reformere 3D-strukturer.
