Pour commencer, prenez une assiette de culture de 24 puits précédemment assise et placez un couvercle en verre dans chaque puits. Ajoutez ensuite 800 microlitres de milieu de culture contenant 10% FBS et DMEM. Après ajustement de la concentration cellulaire.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Ensuite, jetez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS. Suspendre les cellules dans 800 microlitres de milieu d’induction DMEM contenant du BSA.
Dissoudre l’acide linoléique dans de l’éthanol anhydre pour préparer une solution étalon à une concentration de 100 millimolaires par litre. Ajouter l’acide linoléique en gradient croissant à la plaque et répéter quatre fois. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
À la fin de l’incubation, retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixez-les avec 400 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4% pendant 20 minutes. Ensuite, jetez la solution fixatrice et lavez-les à nouveau.
Incuber les cellules avec de l’alcool isopropylique à 60% pendant cinq minutes, puis les jeter. Ajouter la solution de travail d’huile rouge O fraîchement préparée et jetez-la après 20 à 30 minutes. Lavez les cellules avec du PBS deux à cinq fois jusqu’à ce que l’excès de solution de colorant soit éliminé.
Recolorer le noyau avec 300 microlitres de solution d’hématoxyline pendant une à deux minutes. Ensuite, jetez la solution de colorant et lavez-les à nouveau. Retirez le couvercle en verre de la plaque lavée PBS et placez-le avec les cellules vers le bas sur une lame microscopique contenant 10 microlitres de mastic pour comprimés.
Pour mesurer la taille et le nombre de LD, allumez successivement l’interrupteur de l’ordinateur et du microscope et placez la lame sur la plate-forme de chargement. Ouvrez ensuite le logiciel d’analyse d’images. Trouvez les images à faible puissance et versez une quantité appropriée d’huile de cèdre sur la lame d’imagerie.
Ajustez progressivement l’objectif 200x et ajustez le champ de vision jusqu’à ce qu’une image claire soit trouvée. Ensuite, capturez des images des régions souhaitées et enregistrez-les. Au hasard, sélectionnez 60 LD pour chaque image et mesurez le diamètre.
Exportez les résultats de mesure dans un tableau pour analyser la taille moyenne et le ratio de distribution des LD. Les cellules colorées en culture d’hépatocytes présentaient différentes tailles et nombres de LD. Sous les différentes concentrations de traitement à l’acide linoléique.
Le nombre de LD par cellule était négativement corrélé avec différentes concentrations d’acide linoléique. Le nombre médian de LD par cellule était de 136 pour le groupe traité à 100 micromolaires par litre d’acide linoléique et a diminué à des concentrations élevées. Le diamètre moyen des LD dans le groupe témoin était de 0,72 micromètre, ce qui augmentait avec l’augmentation de la concentration dans le groupe traité à l’acide linoléique.
Une concentration élevée d’acide linoléique augmentait la proportion de LD importantes et diminuait les petites LD.
