Name: Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets LDs in Bovine Hepatocyte Cells at JoVE.com

oil red o staining and measurement of lipid droplets (lds) in bovine hepatocyte cells

Lipid Damlacık Boyutu ve Füzyonunun Oil Red O ve BODIPY Kullanılarak Canlı Hücre Görüntülemesi

Lipid droplet (LD) accumulation in hepatocytes is the typical characteristic of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which can progress to liver fibrosis and hepatocellular carcinoma. It has been found that the earliest manifestation of fatty liver disease is steatosis, characterized by LD accumulation in the cytoplasm of the hepatocyte1. Liver steatosis is invariably associated with an increased number and/or expanded size of LDs2. LDs are thought to be generated from the endoplasmic reticulum (ER), consisting of triglyceride (TG) as the core, and are surrounded by proteins and phospholipids3. As the subcellular organelle responsible for TG storage, LDs exhibit different features regarding their size, number, lipid composition, proteins, and interaction with other organelles, all of which affect cell energy homeostasis4. The TG level is positively correlated with the size of LDs, and a higher intracellular TG content could form larger LDs5. LDs increase in size through the local synthesis of TG, lipid incorporation in the ER, and the fusion of multiple LDs6. Cells (adipocytes, hepatocytes, etc.) that contain large LDs have a special mechanism to efficiently increase lipid storage by LD fusion. The dynamic changes of LDs reflect the different energy metabolism states of the cell. It is crucial to develop methodologies that allow the observation and analysis of the various hepatic LDs in healthy and abnormal cells.
The main non-fluorescent dyes for LDs are Sudan Black B and oil red O. Sudan Black B stains neutral lipids, phospholipids, and steroids7. Oil red O is mainly used for staining LDs of skeletal muscle, cardiomyocytes, liver tissue, adipose cells, etc8., and is considered a standard tool for the quantitative detection of liver steatosis in mice and humans9. The dynamic change of LDs is mainly carried out by fluorescence dyeing. Nile red and BODIPY are both commonly used fluorescent lipid dyes10,11. Compared with Nile red, BODIPY has stronger tissue permeability and binds better with LDs12. BODIPY-labeled LDs can be used for staining living cells and colocalization with other organelles13.
The incidence of fatty liver disease is significantly higher in ruminant animals than in monogastric animals14. During the transition period, dairy cows experience a state of negative energy balance3. Large quantities of non-esterified fatty acids (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, etc.) are synthesized into TGs in bovine hepatocytes, which leads to liver functional abnormality and greatly reduces the quality of milk products and production efficiency15. The present study aims to provide a protocol to analyze the size and the number of LDs, as well as to monitor the LD fusion dynamics. We constructed a model of LD formation by adding different concentrations of linoleic acid (LA) in hepatocytes16 and observed the changes in the size and the number of LDs during the process by staining LDs with oil red O. In addition, the process of the rapid fusion of LDs was also observed by staining with BODIPY 493/503.

Yazar Spotlight: Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Boyutunun ve Füzyonunun Değerlendirilmesi  

Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Our research focus on the lipid droplet number and the size induced by linoleic acid in liver cells. Additionally, we aim to provide insights into the mechanism of the fatty liver. Recent advancements in this field of research, suggests that choline, CCT alpha, established induced autophagy, can regulate lipid droplet size in bovine hepatic cells.Moreover, living cell workstation observations have shown that phospholipids have a considerable effect on lipid droplet fusion. Currently, gene aiding, fluorescence tweezer, liquid chromatography, omics analysis, single chromatography, flow cytometry, and other technologies are being used to group the vast research in this field. The experimental method has some limitations.For example, the phenomenon of limited fields can only be observed for lipid droplet fields and under a certain flight of waste. Oil Red O staining is more convenient, less expensive, and more widely used to measure the apparent size of lipid droplets than lipid droplet fluorescence staining. It is simple to operate and requires less equipment.Furthermore, we directly observe this phenomenal of lipid fusion through the living cell station. This study provide a simple and repeatable method to observe lipid droplet size and fusion, which can be widely applied to lipid droplet analysis in cellular lipid metabolism research. We will continue to conduct intensive research on lipid droplets, focusing on the mechanism of lipid droplet fusion and the structure changes of fatty liver in dairy cows.

Watch this Scientific Journal Video about Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets LDs in Bovine Hepatocyte Cells at JoVE.com

Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells  

Yağ Kırmızısı O Sığır Hepatosit Hücrelerinde Lipit Damlacıklarının (LD) Boyanması ve Ölçümü

Başlamak için, daha önce oturmuş 24 kuyulu bir kültür plakası alın ve her bir kuyucuğa bir cam kapak kayması yerleştirin. Ardından,% 10 FBS ve DMEM içeren 800 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Hücre konsantrasyonunu ayarladıktan sonra.24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra kültür ortamını atın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri BSA içeren 800 mikrolitre DMEM indüksiyon ortamında askıya alın.Litre başına 100 milimolar konsantrasyonda standart bir çözelti hazırlamak için linoleik asidi susuz etanol içinde çözün. Plakaya artan gradyanda linoleik asit ekleyin ve dört kez tekrarlayın. Daha sonra plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.İnkübasyonun sonunda, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Bunları 20 dakika boyunca 400 mikrolitre% 4 paraform aldehit ile sabitleyin. Sonra fiksatif çözeltiyi atın ve tekrar yıkayın.Hücreleri% 60 izopropil alkol ile beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma çözeltisini ekleyin ve 20 ila 30 dakika sonra atın. Fazla boya çözeltisi çıkarılana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.Çekirdeği 300 mikrolitre hematoksilin çözeltisi ile bir ila iki dakika bekletin. Sonra boya çözeltisini atın ve tekrar yıkayın. Cam kapak kayışını PBS yıkanmış plakadan çıkarın ve 10 mikrolitre tablet sızdırmazlık maddesi içeren mikroskobik bir slayt üzerine aşağı bakan hücrelerle yerleştirin.LD'lerin boyutunu ve sayısını ölçmek için, bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın ve slaytı yükleme platformuna yerleştirin. Ardından görüntü analiz yazılımını açın. Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın.200x hedefini kademeli olarak ayarlayın ve net bir görüntü bulunana kadar görüş alanını ayarlayın. Ardından istediğiniz bölgelerden görüntüler yakalayın ve kaydedin. Rastgele olarak, her görüntü için 60 LD seçin ve çapı ölçün.LD'lerin ortalama boyutunu ve dağılım oranını analiz etmek için ölçüm sonuçlarını bir tabloya aktarın. Boyanmış hepatosit kültürlü hücreler farklı boyutlarda ve sayıda LD gösterdi. Linoleik asit tedavisinin farklı konsantrasyonları altında.Hücre başına LD sayısı, farklı linoleik asit konsantrasyonları ile negatif korelasyon gösterdi. Hücre başına medyan LD sayısı, litre linoleik asit ile muamele edilen grup başına 100 mikromolar için 136 idi ve yüksek konsantrasyonlarda azaldı. Kontrol grubundaki LD'lerin ortalama çapı 0.72 mikrometre idi ve linoleik asitle tedavi edilen grupta artan konsantrasyonla artmıştır.Yüksek linoleik asit konsantrasyonu, büyük LD'lerin oranını arttırdı ve küçük LD'leri azalttı.

Research

JoVE Journal

Biology

Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...