قبل البدء ، قم بإجراء عزل الخلايا الليفية الزليلية واستخدم الخلايا غير الملتصقة التي تم جمعها من الطبق المطلي بالكولاجين في هذا الإجراء. بذر الخلايا غير الملتصقة على أطباق 40 إلى 60 ملم لم يتم تغطيتها بالكولاجين. استزرع الخلايا السائبة ليوم واحد عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لإزالة الخلايا الليمفاوية غير الملتصقة ، قم بنضح الوسط المستزرع ثم أضف وسط استزراع جديد. استزرع الخلايا السائبة الملتصقة لمدة أسبوع إلى أسبوعين مع تغييرات متوسطة كل يومين ، مع الحفاظ على التقاء. ثم اغسل مرتين مع PBS أو HBSS.
اختر الضامة الزليلية عن طريق المعالجة بنسبة 0.05٪ من التربسين في HBSS واحتضانها لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم أضف وسط الاستزراع برفق إلى 0.05٪ تربسين في HBSS. بعد هذه الخطوة ، لا تصب الوسط مباشرة على الخلايا.
لإزالة الخلايا المنفصلة ، قم بشفط الوسط المزروع ثم أضف وسط ثقافة جديد برفق. كرر مرتين أو ثلاث مرات وحافظ على الخلايا على الطبق في وسط ثقافة طازجة حتى الاستخدام. تم عزل الخلايا الشبيهة بالبلاعم من إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر سبعة إلى ثمانية أسابيع وتحليلها بواسطة RT-qPCR.
أظهر تعبير mRNA لعلامات البلاعم الشاملة CD68 و EMR1 و ITGAM و CSF1R عزلة غنية بالبلاعم من نسيج التهاب الغشاء المفصلي. لإثبات نقاء البلاعم ، تم تحليل علامات البروتين السطحي للبلاعم وأنواع الخلايا الأخرى عن طريق قياس التدفق الخلوي. أكثر من 90٪ من الخلايا عبرت عن علامات البلاعم CD45 و CD11b و F4 / 80 ، في حين أن التعبير عن علامة العدلات Ly6G وعلامة الخلايا التائية CD3 كان أقل من 1٪