Før du begynner, utfør synovial fibroblastisolasjon og bruk de ikke-adherente cellene samlet fra kollagenbelagt parabolen i denne prosedyren. Frø de ikke-adherente cellene på 40 til 60 millimeter retter som ikke er belagt med kollagen. Dyrk bulkcellene i en dag ved 37 grader Celsius i en fuktet atmosfære med 5% karbondioksid.
For å fjerne ikke-adherente lymfocytter, aspirer det dyrkede mediet og tilsett deretter nytt kulturmedium. Dyrk de adherente bulkcellene i en til to uker med middels endringer annenhver dag, samtidig som sammenløpet opprettholdes. Vask deretter to ganger med PBS eller HBSS.
Velg for synoviale makrofager ved å behandle med 0,05 % trypsin i HBSS og inkuber i tre minutter ved 37 grader Celsius i en fuktet atmosfære med 5 % karbondioksid. Deretter tilsettes kulturmedium forsiktig til 0,05% trypsin i HBSS. Etter dette trinnet må du ikke helle mediet direkte på cellene.
For å fjerne frittliggende celler, aspirer det dyrkede mediet og tilsett deretter friskt kulturmedium forsiktig. Gjenta to eller tre ganger og hold cellene på fatet i friskt kulturmedium til bruk. Makrofaglignende celler ble isolert fra syv til åtte uker gamle kvinnelige C57BL/6-mus og analysert av RT-qPCR.
mRNA-ekspresjon av panmakrofagmarkørene CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R viste makrofagrik isolasjon fra synovittvevet. For å fastslå renheten til makrofager ble overflateproteinmarkører for makrofager og andre celletyper analysert ved flowcytometri. Mer enn 90 % av cellene uttrykte makrofagmarkørene CD45, CD11b og F4/80, mens ekspresjonen av nøytrofilmarkøren Ly6G og T-cellemarkøren CD3 var lavere enn 1 %