بعد استنساخ الجين محل الاهتمام في ITR المرتبط بالغدي الذي يحتوي على البلازميد ، قم بالبذور ثلاث مرات من 10 إلى الخلايا الخامسة في صفيحة من ستة آبار باستخدام DMEM المسخن مسبقا والمكمل ب 10٪ FBS. اسمح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للوصول إلى التقاء 75 إلى 90٪. بعد ذلك ، قم بإذابة 100 ملليغرام من بولي إيثيلينيمين هيدروكلوريد أو PEI كحد أقصى في 100 ملليلتر من الماء المقطر لعمل ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.
اضبط الأس الهيدروجيني على 7.1 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. ثم تعقيم الخليط باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزين الكاشف لمدة شهر واحد عند أربع درجات مئوية. في أنبوب 2 ملليلتر ، أضف 1.3 ميكروغرام من البلازميد / الغطاء ، و 1.3 ميكروجرام ITR يحتوي على البلازميد ، و 2.6 ميكروجرام من البلازميد المساعد للفيروس الغدي إلى DMEM الخالي من المصل.
يجب أن يكون الحجم الكلي لهذا الخليط 100 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي في أنبوب منفصل ، مع استبدال بلازميد rep / cap ببلازميد غير ذي صلة. أضف الآن 5.2 ميكرولتر من PEI max إلى خليط البلازميد.
هذا يحافظ على نسبة البلازميد إلى PEI متساوية. دوامة بلطف 10 إلى 15 مرة على خلاط دوامة مضبوط على سبعة. بالنسبة للمتجهات المتعددة ، قم بترتيب إضافة PEI على فترات دقيقة واحدة للحصول على وقت كاف في الخطوات اللاحقة.
احتضان كل أنبوب لمدة 15 دقيقة بالضبط في درجة حرارة الغرفة. ثم خفف التفاعل بإضافة 1.9 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل لتحقيق حجم نهائي قدره 2 ملليلتر. ماصة بلطف مرتين لخلط المحتويات.
نضح الوسائط من البئر. أضف بعناية خليط البلازميد PEI إلى جوانب البئر لتجنب انفصال الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتجميد صفيحة الخلايا المنقولة لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وذوبان الجليد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
كرر الدورة ما مجموعه ثلاث مرات. في غطاء التدفق الصفحي ، امزج كل بئر بشكل معقم عن طريق سحب الخلايا لتعطيل الخلايا بشكل فعال. نقل المحللة إلى أنبوب 2 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي عند 15،000 G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة حطام الخلية ونقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد سعة 2 ملليلتر وتخزين الأنبوب عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، ضع نوع الخلية المطلوب في صفيحة 96 بئرا واحتضانها لالتقاء مستهدف من 50 إلى 75٪ اعتمادا على مدة النقل. في اليوم التالي ، قم بإجراء سلسلة تخفيف من واحد إلى ثلاثة من المستحضر الخام في وسائط خالية من المصل للحصول على الكمية المثلى من المتجه المطلوب للنقل.
ثم قم باستنشاق الوسائط من لوحة 96 بئرا وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من المستحضر الخام المخفف إلى الآبار. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحديد كفاءة التنبيغ ، لاحظ تعبير مراسل الفلورسنت باستخدام مجهر الفلورسنت في 48 ساعة بعد النقل.
لمزيد من التحليل ، قم بإزالة المتجه وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا. أخيرا ، قم بإنهاء النقل عن طريق تثبيت الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. أشارت بيانات كفاءة التحويل إلى أن AAV2 و KP1 كانا أقوى الأنماط المصلية عبر جميع خطوط الخلايا المختبرة.
أظهر HEPA1-6 انخفاضا ملحوظا في التنبيغ مقارنة ب Huh7. قام AAV2 بتحويل الخلايا العضلية HSKMC غير المتمايزة بكفاءة والأنابيب العضلية HSKMC المتمايزة. تلعب ظروف الوسائط المختلفة دورا مهما أثناء النقل.
كانت الكائنات العضوية المعوية الصغيرة المستزرعة في وسائط ما قبل النقل أقل فعالية مقارنة بتلك المستزرعة في وسائط النمو العضوي.