Efter kloning af genet af interesse i adeno-associeret ITR indeholdende plasmid, frø tre gange 10 til de femte celler i en seks-brøndplade ved hjælp af forvarmet DMEM suppleret med 10%FBS. Lad cellerne vokse ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid for at opnå 75 til 90% sammenløb. Derefter opløses 100 milligram polyethylenaminhydrochlorid eller PEI max i 100 ml destilleret vand for at fremstille et mikrogram pr. Mikroliter lager.
pH justeres til 7,1 ved hjælp af natriumhydroxid. Derefter steriliseres blandingen ved hjælp af et 0,22 mikrometer filter og opbevares reagenset i en måned ved fire grader Celsius. I et to milliliter rør tilsættes 1,3 mikrogram rep / cap plasmid, 1,3 mikrogram ITR indeholdende plasmid og 2,6 mikrogram adenovirushjælperplasmid til serumfri DMEM.
Det samlede volumen af denne blanding skal være 100 mikroliter. Forbered en negativ kontrol i et separat rør, erstat rep / cap plasmid med et ikke-relateret plasmid. Tilsæt nu 5,2 mikroliter PEI max til plasmidblandingen.
Dette opretholder et lige plasmid til PEI-forhold. Vortex forsigtigt 10 til 15 gange på en hvirvelblander indstillet til syv. For flere vektorer forskydes PEI-tilføjelsen med et minuts intervaller i tilstrækkelig tid i efterfølgende trin.
Inkuber hvert rør i nøjagtigt 15 minutter ved stuetemperatur. Fortynd derefter reaktionen ved at tilsætte 1,9 ml serumfrit DMEM for at opnå et endeligt volumen på to ml. Afpipetter forsigtigt to gange for at blande indholdet.
Aspirer medier fra brønden. Tilsæt forsigtigt plasmidet PEI-blandingen til siderne af brønden for at undgå cellefrigørelse og inkubere celler i 72 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Frys derefter pladen af transfekterede celler i 30 minutter ved minus 80 grader Celsius og optø i 30 minutter ved 37 grader Celsius.
Gentag cyklussen i alt tre gange. I en laminær strømningshætte blandes hver brønd aseptisk ved pipettering for at forstyrre celler effektivt. Overfør lysatet til et to milliliter rør.
Der centrifugeres ved 15.000 G i 15 minutter ved stuetemperatur for at fjerne cellerester og overfør forsigtigt supernatanten til et nyt to-ml-rør og opbevar røret ved fire grader Celsius. Derefter plades den ønskede celletype i en 96-brøndplade og inkuberes for en målsammenløb på 50 til 75% afhængigt af transduktionsvarigheden. Den følgende dag udføres en en-til-tre fortyndingsserie af det rå præparat i serumfrie medier for at opnå den optimale mængde vektor, der kræves til transduktion.
Derefter aspireres medierne fra 96-brøndpladen og tilsættes 50 til 100 mikroliter fortyndet råpræparat til brøndene. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. For at bestemme transduktionseffektiviteten skal du observere ekspressionen af den fluorescerende reporter ved hjælp af et fluorescerende mikroskop 48 timer efter transduktion.
For yderligere analyse fjernes vektoren og vaskes en gang med forvarmet PBS. Endelig afsluttes transduktionen ved at fiksere celler i 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Transduktionseffektivitetsdata antydede, at AAV2 og KP1 var de mest potente serotyper på tværs af alle de testede cellelinjer.
HEPA1-6 udviste et markant fald i transduktion sammenlignet med Huh7. AAV2 transducerede effektivt udifferentierede HSKMC-myoblaster og differentierede HSKMC-myorør. Forskellige medieforhold spiller en vigtig rolle under transduktion.
Tyndtarmsorganoider dyrket i prætransduktionsmedier blev mindre effektivt transduceret sammenlignet med dem, der blev dyrket i organoide vækstmedier.