Nach der Klonierung des interessierenden Gens in Adeno-assoziiertem ITR-haltigem Plasmid werden dreimal 10 bis fünfte Zellen in eine Sechs-Well-Platte gesät, wobei vorgewärmtes DMEM mit 10 % FBS angereichert wird. Lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid wachsen, um einen Zusammenfluss von 75 bis 90 % zu erreichen. Als nächstes lösen Sie 100 Milligramm Polyethyleniminhydrochlorid oder PEI max in 100 Milliliter destilliertem Wasser auf, um ein Mikrogramm pro Mikroliter Brühe herzustellen.
Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,1 ein. Anschließend sterilisieren Sie die Mischung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter und lagern Sie das Reagenz einen Monat lang bei vier Grad Celsius. In einem Zwei-Milliliter-Röhrchen 1,3 Mikrogramm Rep/Cap-Plasmid, 1,3 Mikrogramm ITR-haltiges Plasmid und 2,6 Mikrogramm Adenovirus-Helferplasmid zu serumfreiem DMEM hinzufügen.
Das Gesamtvolumen dieser Mischung sollte 100 Mikroliter betragen. Bereiten Sie eine Negativkontrolle in einem separaten Röhrchen vor und ersetzen Sie das Rep/Cap-Plasmid durch ein nicht verwandtes Plasmid. Geben Sie nun 5,2 Mikroliter PEI max in die Plasmidmischung.
Dadurch wird ein gleiches Verhältnis von Plasmid zu PEI aufrechterhalten. 10 bis 15 Mal vorsichtig auf einem auf sieben eingestellten Vortex-Mischer vortexen. Bei mehreren Vektoren wird die PEI-Zugabe in Intervallen von einer Minute gestaffelt, um in den nachfolgenden Schritten genügend Zeit zu haben.
Inkubieren Sie jedes Röhrchen genau 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 1,9 Millilitern serumfreiem DMEM, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erreichen. Zweimal vorsichtig pipettieren, um den Inhalt zu mischen.
Saugen Sie Medien aus dem Brunnen ab. Geben Sie die Plasmid-PEI-Mischung vorsichtig an die Seiten der Vertiefung, um eine Zellablösung zu vermeiden, und inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dann frieren Sie die Platte der transfizierten Zellen für 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius ein und tauen sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.
Wiederholen Sie den Zyklus insgesamt dreimal. Mischen Sie in einer Laminar-Flow-Haube jede Vertiefung aseptisch durch Pipettieren, um die Zellen effektiv aufzubrechen. Das Lysat wird in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie bei 15.000 G für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen, und geben Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen um und lagern Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius. Als nächstes wird der gewünschte Zelltyp in einer 96-Well-Platte plattiert und für eine Zielkonfluenz von 50 bis 75 % inkubiert, abhängig von der Transduktionsdauer. Am nächsten Tag wird eine bis drei Verdünnungsreihen des Rohpräparats in serumfreien Medien durchgeführt, um die optimale Menge an Vektor zu erhalten, die für die Transduktion erforderlich ist.
Anschließend wird das Medium aus der 96-Well-Platte abgesaugt und 50 bis 100 Mikroliter verdünntes Rohöl in die Wells gegeben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um die Transduktionseffizienz zu bestimmen, wird die Expression des Fluoreszenzreporters 48 Stunden nach der Transduktion mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
Für die weitere Analyse entfernen Sie den Vektor und waschen die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS. Beenden Sie schließlich die Transduktion, indem Sie die Zellen 10 Minuten lang in 4%igem Paraformaldehyd fixieren. Die Daten zur Transduktionseffizienz deuteten darauf hin, dass AAV2 und KP1 die wirksamsten Serotypen in allen getesteten Zelllinien waren.
HEPA1-6 zeigte eine deutliche Abnahme der Transduktion im Vergleich zu Huh7. AAV2 transduzierte effizient undifferenzierte HSKMC-Myoblasten und differenzierte HSKMC-Myotuben. Unterschiedliche Medienbedingungen spielen bei der Transduktion eine wichtige Rolle.
Dünndarm-Organoide der Maus, die in Prä-Transduktionsmedien kultiviert wurden, wurden im Vergleich zu denen, die in Organoid-Wachstumsmedien kultiviert wurden, weniger effektiv transduziert.
