プラスミドを含むアデノ随伴ITRの目的遺伝子をクローニングした後、10%FBSを添加した予熱DMEMを使用して、5番目の細胞に10倍の細胞を3回播種し、6ウェルプレートに入れます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で増殖させて、75〜90%のコンフルエンスを達成します。次に、100ミリグラムのポリエチレンイミン塩酸塩またはPEI maxを100ミリリットルの蒸留水に溶解して、1マイクロリットルストックあたり1マイクログラムにします。
水酸化ナトリウムを使用してpHを7.1に調整します。次に、0.22マイクロメートルのフィルターを使用して混合物を滅菌し、摂氏4度で1か月間試薬を保存します。2ミリリットルのチューブに、1.3マイクログラムのrep/capプラスミド、1.3マイクログラムのITR含有プラスミド、および2.6マイクログラムのアデノウイルスヘルパープラスミドを無血清DMEMに加えます。
この混合物の総容量は100マイクロリットルでなければなりません。別のチューブでネガティブコントロールを調製し、rep/cap プラスミドを無関係なプラスミドと交換します。次に、プラスミド混合物に5.2マイクロリットルのPEI maxを加えます。
これにより、プラスミドとPEIの比率が等しくなります。7に設定したボルテックスミキサーで10〜15回静かにボルテックスします。複数のベクターの場合、後続のステップで十分な時間を確保するために、PEI添加を1分間隔でずらします。
各チューブを室温で正確に15分間インキュベートします。次に、1.9ミリリットルの無血清DMEMを添加して反応を希釈し、最終容量を2ミリリットルにします。静かに2回ピペットで移し、内容物を混ぜ合わせます。
ウェルから培地を吸引します。プラスミドPEI混合物をウェルの側面に慎重に加え、細胞の剥離を防ぎ、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。次に、トランスフェクションした細胞のプレートを摂氏マイナス80度で30分間凍結し、摂氏37度で30分間融解します。
このサイクルを合計3回繰り返します。層流フードでは、ピペッティングにより各ウェルを無菌的に混合し、細胞を効果的に破壊します。ライセートを2ミリリットルのチューブに移します。
室温で15、000 Gで15分間遠心分離し、細胞の破片を除去し、上清を新しい2ミリリットルのチューブに慎重に移し、チューブを摂氏4度で保管します。次に、目的の細胞タイプを96ウェルプレートに播種し、形質導入期間に応じて50〜75%の目標コンフルエントになるようにインキュベートします。翌日、無血清培地中で粗調製物を1〜3回希釈して、形質導入に必要な最適な量のベクターを得ます。
次に、96ウェルプレートから培地を吸引し、50〜100マイクロリットルの希釈粗製剤をウェルに加えます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。形質導入効率を決定するには、形質導入後48時間で蛍光顕微鏡を使用して蛍光レポーターの発現を観察します。
さらに分析するには、ベクターを除去し、予熱したPBSで細胞を一度洗浄します。最後に、細胞を4%パラホルムアルデヒドに10分間固定して形質導入を終了します。形質導入効率データは、AAV2およびKP1が、試験したすべての細胞株において最も強力な血清型であることを示唆しました。
HEPA1-6はHuh7と比較して形質導入の著しい減少を示した。AAV2は、未分化のHSKMC筋芽細胞および分化したHSKMC筋チューブを効率的に形質導入しました。形質導入では、さまざまな培地条件が重要な役割を果たします。
形質導入前培地で培養したマウス小腸オルガノイドは、オルガノイド増殖培地で培養したオルガノイドと比較して、より効果的に形質導入が低かった。
