Después de clonar el gen de interés en el plásmido que contiene ITR adenoasociado, siembre tres veces 10 a la quinta célula en una placa de seis pocillos utilizando DMEM precalentado suplementado con FBS al 10%. Deje que las células crezcan a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para alcanzar una confluencia del 75 al 90%. A continuación, disuelva 100 miligramos de clorhidrato de polietilenimina o PEI max en 100 mililitros de agua destilada para hacer un microgramo por microlitro de caldo.
Ajuste el pH a 7.1 usando hidróxido de sodio. A continuación, esterilizar la mezcla con un filtro de 0,22 micrómetros y almacenar el reactivo durante un mes a cuatro grados centígrados. En un tubo de dos mililitros, agregue 1,3 microgramos de plásmido rep/tapón, 1,3 microgramos de plásmido que contenga ITR y 2,6 microgramos de plásmido auxiliar de adenovirus al DMEM libre de suero.
El volumen total de esta mezcla debe ser de 100 microlitros. Prepare un control negativo en un tubo separado, reemplazando el plásmido rep/cap con un plásmido no relacionado. Ahora agregue 5.2 microlitros de PEI max a la mezcla de plásmidos.
Esto mantiene una proporción igual de plásmido a PEI. Suavemente vórtice de 10 a 15 veces en un mezclador de vórtice ajustado a siete. Para vectores múltiples, escalonar la adición de PEI a intervalos de un minuto durante el tiempo suficiente en los pasos siguientes.
Incuba cada tubo durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, diluir la reacción añadiendo 1,9 mililitros de DMEM libre de suero para conseguir un volumen final de dos mililitros. Pipetear suavemente dos veces para mezclar el contenido.
Aspire los medios del pozo. Agregue con cuidado la mezcla de plásmidos PEI a los lados del pocillo para evitar el desprendimiento de células e incube las células durante 72 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, congele la placa de células transfectadas durante 30 minutos a menos 80 grados centígrados y descongele durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Repite el ciclo un total de tres veces. En una campana de flujo laminar, mezcle asépticamente cada pocillo pipeteando para interrumpir las células de manera efectiva. Transfiera el lisado a un tubo de dos mililitros.
Centrifugar a 15.000 G durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares y transferir cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros y almacenar el tubo a cuatro grados centígrados. A continuación, coloque el tipo de célula deseado en una placa de 96 pocillos e incube para obtener una confluencia objetivo del 50 al 75 %, dependiendo de la duración de la transducción. Al día siguiente, realice una serie de dilución de una a tres del preparado crudo en medios libres de suero para obtener la cantidad óptima de vector requerida para la transducción.
A continuación, aspire el medio de la placa de 96 pocillos y añada de 50 a 100 microlitros de preparación de crudo diluido a los pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para determinar la eficiencia de la transducción, observe la expresión del indicador fluorescente utilizando un microscopio fluorescente a las 48 horas después de la transducción.
Para un análisis más detallado, retire el vector y lave las células una vez con PBS precalentado. Finalmente, finalice la transducción fijando las células en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Los datos de eficiencia de transducción sugirieron que AAV2 y KP1 fueron los serotipos más potentes en todas las líneas celulares probadas.
HEPA1-6 mostró una marcada disminución en la transducción en comparación con Huh7. AAV2 transdució eficientemente mioblastos indiferenciados de HSKMC y miotubos diferenciados de HSKMC. Las diferentes condiciones del medio juegan un papel importante durante la transducción.
Los organoides del intestino delgado de ratón cultivados en medios de pre-transducción se transducieron de manera menos efectiva en comparación con los cultivados en medios de crecimiento de organoides.
