Til at begynde med skal du tage den optøede dråbe digitale eller ddPCR-masterblanding og tilføje sonder, fremadgående primer og omvendt primer til den ved stuetemperatur. Forbered masterblandingen for hvert forstærkningsmål efter den foreslåede sammensætning, der vises på skærmen, og juster koncentrationerne af primere og sonder efter behov. Vortex blandingen grundigt og centrifuger den kort i en minicentrifuge.
Tilsæt restriktionsenzymet og inverter for at blande. Derefter tilsættes 16,5 mikroliter af den forberedte masterblanding til hver brønd i en PCR-plade og forsegles pladen med en gennemsigtig klæbende film. Brug prøvefortyndingsbufferen som fortyndingsmiddel, forbered kvalitetskontrol eller QC-fortyndinger som beskrevet i denne tabel, som repræsenterer de anbefalede koncentrationer for en valideringsnøjagtighed og præcisionskørsel.
Fortynd tåreprøverne med en prøvefortyndingsbuffer i forholdet 1 til 10 i 0,2 ml PCR-rør, og forsegl rørene. Opvarm prøverne i en termocyklisk maskine ved 95 grader Celsius i 10 minutter og derefter ved 4 grader Celsius i mindst 5 minutter. Fjern klæbefilmen fra ddPCR-pladen, der indeholder masterblandingen, og tilsæt 5,5 mikroliter QC-fortynding til passende brønde på 96-brøndpladen som vist på pladekortet.
Derefter tilsættes 5,5 mikroliter prøve til brøndene. Tilsæt 5,5 mikroliter prøvefortyndingsbuffer til ingen skabelonkontrol eller NTC-huller. Fortynd 2x ddPCR-bufferkontrol i forholdet 1 til 2 ved hjælp af nukleasefrit vand, og tilsæt 22 mikroliter buffer til eventuelle tomme brønde i en søjle.
Tilsæt en gennemborbar folieforsegling til pladen, og læg pladen i pladeforsegleren. Forsegl pladen i 5 sekunder ved 180 grader Celsius. Vortex pladen ved maksimal hastighed i mindst 30 sekunder og centrifuger kortvarigt i en pladespinner.
På berøringsskærmen for den automatiserede dråbegenerator skal du vælge kolonnerne på pladekortet, der indeholder prøverne. Instrumentets dæk lyser for at indikere, hvilke forbrugsstoffer der kræves. Indlæs dråbegeneratoren bagfra og forfra.
Det gule lys skifter fra gul til grøn for at indikere tilstrækkeligheden af forbrugsstofferne. Anbring en kold blok og dråbepladeholderen. Sørg for, at blokken er helt blå, og at der ikke er nogen lyserød synlig.
Anbring en ny 96 svejset ddPCR-plade i koldblokken. Anbring den forberedte PCR-plade i prøvepladeholderen. Luk maskinens låg, og tryk på start for dråbegenerering.
Inden for 30 minutter fjernes pladen, der indeholder dråberne, fra den kolde blok. Tilsæt en gennemborbar folieforsegling til pladen, og læg pladen i pladeforsegleren. Forsegl det i fem sekunder ved 180 grader Celsius.
Placer derefter pladen i en kompatibel termisk cyklist, og indtast de cykelbetingelser, der vises på skærmen. Læg pladen i dråbelæseren, så der er tilstrækkelig læserolie tilbage, og affaldsbeholderen har tilstrækkelig plads. Til sidst skal du trykke på læseknappen på softwaren for at begynde at læse dråberne.
Der blev beregnet et gennemsnit inden for assay for hver koncentration i hvert assay, som blev anvendt til at vurdere analysens præcision og nøjagtighed. En gennemsnitlig inter-assay-præcision på 7,7% og en gennemsnitlig absolut inter-assay-nøjagtighed på 4,2% blev fundet på tværs af alle QC-niveauer. Inter-assay nøjagtighed og præcision blev også beregnet ved hjælp af inter-assay gennemsnit af hvert QC-niveau inden for hver batch.
Der blev fundet en præcision mellem assayene fra 4 til 8,5 % og en absolut nøjagtighed mellem assayene fra en til 3,2 %. Tilsvarende blev der for tåreprøven observeret en gennemsnitlig inter-assay-præcision på 3,7% ved det høje spike-niveau og 12,2% ved det lave spike-niveau og en gennemsnitlig inter-assay absolut nøjagtighed på 11,3% ved det høje niveau og 8,1% ved det lave niveau. Ved inter assay-beregninger blev der fundet en præcision på 5,5% på det høje niveau og 7,1% på det lave niveau og en absolut nøjagtighed på 11,3% på det høje niveau og 8,1% på det lave niveau.
