Neem om te beginnen de ontdooide druppel digital, of ddPCR master mix en voeg er sondes, forward primer en reverse primer aan toe bij kamertemperatuur. Bereid de mastermix voor elk versterkingsdoel voor volgens de voorgestelde samenstelling die op het scherm wordt weergegeven en pas de concentraties van primers en sondes indien nodig aan. Vortex het mengsel grondig en kort centrifugeren in een minicentrifuge.
Voeg het restrictie-enzym toe en keer om om te mengen. Voeg vervolgens 16,5 microliter van de voorbereide mastermix toe aan elke put van een PCR-plaat en sluit de plaat af met een transparante kleeffilm. Gebruik de monsterverdunningsbuffer als verdunningsmiddel en bereid kwaliteitscontrole of QC-verdunningen voor zoals beschreven in deze tabel, die de aanbevolen concentraties weergeeft voor een validatienauwkeurigheid en precisie.
Verdun de traanmonsters met een monsterverdunningsbuffer in een verhouding van 1 op 10 in PCR-buizen van 0,2 milliliter en sluit de buizen af. Verwarm de monsters in een thermocycler op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten en vervolgens op 4 graden Celsius gedurende ten minste 5 minuten. Verwijder de kleeffolie van de ddPCR-plaat met de mastermix en voeg 5,5 microliter QC-verdunning toe aan de juiste putjes van de 96-putplaat zoals aangegeven op de plaatkaart.
Voeg vervolgens 5,5 microliter monster toe aan de putjes. Voeg 5,5 microliter monsterverdunningsbuffer toe aan de no template control of NTC-putjes. Verdun 2x ddPCR buffercontrole in een verhouding van 1 op 2 met nucleasevrij water en voeg 22 microliter van de buffer toe aan lege putten van een kolom.
Voeg een doorboorbare folieafdichting toe aan de plaat en plaats de plaat in de plaatafdichting. Sluit de plaat 5 seconden af op 180 graden Celsius. Draai de plaat op de maximale snelheid gedurende ten minste 30 seconden en centrifugeer kort in een plaatspinner.
Selecteer op het touchscreen van de Automated Droplet Generator de kolommen op de plaatkaart met de monsters. Het dek van het instrument zal oplichten om aan te geven welke verbruiksartikelen nodig zijn. Laad de druppelgenerator van achter naar voren.
Het gele lampje verandert van geel naar groen om de toereikendheid van de verbruiksartikelen aan te geven. Plaats een koud blok en de druppelplaathouder. Zorg ervoor dat het blok volledig blauw gekleurd is en dat er geen roze zichtbaar is.
Plaats een nieuwe 96 lassen ddPCR plaat in het koude blok. Plaats de voorbereide PCR-plaat in de monsterplaathouder. Sluit het deksel van het apparaat en druk op start voor het genereren van druppels.
Verwijder binnen 30 minuten de plaat met de druppels uit het koude blok. Voeg een doorboorbare folieafdichting toe aan de plaat en plaats de plaat in de plaatafdichting. Sluit het vijf seconden af op 180 graden Celsius.
Plaats de plaat vervolgens in een compatibele thermische cycler en voer de fietsomstandigheden in die op het scherm worden weergegeven. Laad de plaat in de druppellezer zodat er voldoende lezer olie overblijft en de afvalcontainer voldoende ruimte heeft. Druk ten slotte op de leesknop in de software om de druppels te lezen.
Een intra-assaygemiddelde voor elke concentratie in elke assay werd berekend en dit werd gebruikt om de precisie en nauwkeurigheid van de assay te beoordelen. Een gemiddelde inter-assay precisie van 7,7% en een gemiddelde absolute inter-assay nauwkeurigheid van 4,2% werden gevonden op alle QC niveaus. De nauwkeurigheid en precisie tussen de assays werden ook berekend met behulp van het inter-assay gemiddelde van elk QC-niveau binnen elke batch.
Een inter-assay precisie variërend van 4-tot-8,5% en een inter-assay absolute nauwkeurigheid variërend van één tot 3,2% werden gevonden. Evenzo werden voor het traanmonster een gemiddelde inter-assay precisie waargenomen van 3,7% op het hoge piekniveau en 12,2% op het lage spikeniveau en een gemiddelde inter-assay absolute nauwkeurigheid van 11,3% op het hoge niveau en 8,1% op het lage niveau. In het geval van inter-assay berekening werd een precisie van 5,5% op het hoge niveau en 7,1% op het lage niveau en een absolute nauwkeurigheid van 11,3% op het hoge niveau en 8,1% op het lage niveau gevonden.