Per iniziare, prendi la goccia scongelata digitale o il master mix ddPCR e aggiungi sonde, primer in avanti e primer inverso a temperatura ambiente. Preparare il master mix per ogni target di amplificazione seguendo la composizione suggerita mostrata sullo schermo e regolare le concentrazioni di primer e sonde secondo necessità. Vortice accuratamente la miscela e centrifugarla brevemente in una mini centrifuga.
Aggiungere l'enzima di restrizione e invertire per mescolare. Quindi, aggiungere 16,5 microlitri della miscela master preparata a ciascun pozzetto di una piastra PCR e sigillare la piastra con un film adesivo trasparente. Utilizzando il tampone di diluizione del campione come diluente, preparare il controllo di qualità o le diluizioni QC come descritto in questa tabella che rappresenta le concentrazioni raccomandate per un'accuratezza di convalida e una corsa di precisione.
Diluire i campioni lacrimali con un tampone di diluizione del campione in un rapporto da 1 a 10 in provette PCR da 0,2 millilitri e sigillare i provette. Riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 gradi Celsius per 10 minuti e poi a 4 gradi Celsius per almeno 5 minuti. Rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra ddPCR contenente la miscela principale e aggiungere 5,5 microlitri di diluizione QC ai pozzetti appropriati della piastra a 96 pozzetti come mostrato nella mappa della piastra.
Quindi aggiungere 5,5 microlitri di campione ai pozzetti. Aggiungere 5,5 microlitri di buffer di diluizione del campione al controllo no template o ai pozzetti NTC. Diluire il controllo del tampone 2x ddPCR in rapporto 1 a 2 utilizzando acqua priva di nucleasi e aggiungere 22 microlitri di tampone a qualsiasi pozzetto vuoto di una colonna.
Aggiungere un sigillo perforabile alla piastra e posizionare la piastra nel sigillante a piastre. Sigillare la piastra per 5 secondi a 180 gradi Celsius. Vortice la piastra alla massima velocità per almeno 30 secondi e centrifugare brevemente in un filatore a piastre.
Sul touchscreen del generatore automatico di gocce, selezionare le colonne sulla mappa delle lastre contenente i campioni. Il deck dello strumento si illuminerà per indicare quali materiali di consumo sono necessari. Caricare il generatore di gocce da dietro a davanti.
La luce gialla cambierà da gialla a verde per indicare la sufficienza dei materiali di consumo. Posizionare un blocco freddo e il portagocce. Assicurati che il blocco sia completamente di colore blu e che non sia visibile alcun rosa.
Posizionare una nuova piastra ddPCR di saldatura 96 nel blocco freddo. Posizionare la piastra PCR preparata nel supporto della piastra del campione. Chiudere il coperchio della macchina e premere start per la generazione di gocce.
Entro 30 minuti, rimuovere la piastra contenente le goccioline dal blocco freddo. Aggiungere un sigillo perforabile alla piastra e posizionare la piastra nel sigillante a piastre. Sigillalo per cinque secondi a 180 gradi Celsius.
Quindi posizionare la piastra in un termociclatore compatibile e inserire le condizioni di ciclismo visualizzate sullo schermo. Caricare la piastra nel lettore di gocce assicurandosi che rimanga sufficiente olio per il lettore e che il contenitore dei rifiuti abbia spazio sufficiente. Infine, premi il pulsante di lettura sul software per iniziare a leggere le goccioline.
È stata calcolata una media intra test per ciascuna concentrazione in ciascun test, utilizzata per valutare la precisione e l'accuratezza del test. Una precisione media inter-test del 7,7% e un'accuratezza media assoluta dell'inter-test del 4,2% sono state trovate in tutti i livelli di controllo qualità. L'accuratezza e la precisione dell'inter-analisi sono state calcolate anche utilizzando la media inter-test di ciascun livello di controllo qualità all'interno di ciascun lotto.
Sono stati trovati una precisione inter-test compresa tra il 4 e l'8,5% e un'accuratezza assoluta inter-test compresa tra uno e 3,2%. Analogamente, per il campione lacrimale è stata osservata una precisione media di inter-test del 3,7% al livello di picco alto e del 12,2% al livello di picco basso e un'accuratezza assoluta media tra test dell'11,3% al livello alto e dell'8,1% al livello basso. Nel caso del calcolo inter test, sono state riscontrate una precisione del 5,5% al livello alto e del 7,1% al livello basso e un'accuratezza assoluta dell'11,3% al livello alto e dell'8,1% al livello basso.
