Başlamak için, çözülmüş damlacık dijital veya ddPCR ana karışımını alın ve oda sıcaklığında problar, ileri astar ve ters astar ekleyin. Ekranda gösterilen önerilen bileşimi izleyerek her bir amplifikasyon hedefi için ana karışımı hazırlayın ve primerlerin ve probların konsantrasyonlarını gerektiği gibi ayarlayın. Karışımı iyice vorteksleyin ve mini bir santrifüjde kısaca santrifüj edin.
Kısıtlama enzimini ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Daha sonra, bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna hazırlanan ana karışımın 16.5 mikrolitresini ekleyin ve plakayı şeffaf bir yapışkan film ile kapatın. Numune seyreltme tamponunu seyreltici olarak kullanmak, kalite kontrolü hazırlamak veya QC seyreltmelerini bu tabloda belirtildiği gibi bir doğrulama doğruluğu ve hassas çalışma için önerilen konsantrasyonları temsil eder.
Gözyaşı numunelerini, 0,2 mililitrelik PCR tüplerinde 1'e 10 oranında bir numune seyreltme tamponu ile seyreltin ve tüpleri kapatın. Numuneleri bir termosiklette 95 santigrat derecede 10 dakika ve daha sonra 4 santigrat derecede en az 5 dakika ısıtın. Yapışkan filmi ana karışımı içeren ddPCR plakasından çıkarın ve plaka haritasında gösterildiği gibi 96 delikli plakanın uygun kuyucuklarına 5,5 mikrolitre QC seyreltme ekleyin.
Daha sonra kuyucuklara 5,5 mikrolitre numune ekleyin. Şablonsuz denetimine veya NTC kuyularına 5,5 mikrolitre numune seyreltme arabelleği ekleyin. 2x ddPCR tampon kontrolünü nükleaz içermeyen su kullanarak 1'e 2 oranında seyreltin ve tamponun 22 mikrolitresini bir sütunun boş kuyucuklarına ekleyin.
Plakaya delinebilir bir folyo contası ekleyin ve plakayı plaka sızdırmazlık elemanına yerleştirin. Plakayı 180 santigrat derecede 5 saniye boyunca kapatın. Plakayı en az 30 saniye boyunca maksimum hızda vorteks edin ve bir plaka eğiricide kısa bir süre santrifüj yapın.
Otomatik Damlacık Oluşturucu'nun dokunmatik ekranında, numuneleri içeren plaka haritasındaki sütunları seçin. Cihazın güvertesi hangi sarf malzemelerinin gerekli olduğunu belirtmek için yanar. Damlacık jeneratörünü arkadan öne doğru yükleyin.
Sarı ışık, sarf malzemelerinin yeterliliğini göstermek için sarıdan yeşile değişecektir. Soğuk bir blok ve damlacık plakası tutucusunu yerleştirin. Bloğun tamamen mavi renkli olduğundan ve pembe görünmediğinden emin olun.
Soğuk bloğa yeni bir 96 kaynak ddPCR plakası yerleştirin. Hazırlanan PCR plakasını numune plakası tutucusuna yerleştirin. Makine kapağını kapatın ve damlacık üretimi için start tuşuna basın.
30 dakika içinde, damlacıkları içeren plakayı soğuk bloktan çıkarın. Plakaya delinebilir bir folyo contası ekleyin ve plakayı plaka sızdırmazlık elemanına yerleştirin. 180 santigrat derecede beş saniye boyunca kapatın.
Ardından plakayı uyumlu bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve ekranda gösterilen döngü koşullarını girin. Yeterli okuyucu yağının kaldığından ve atık kabının yeterli alana sahip olduğundan emin olmak için plakayı damlacık okuyucuya yükleyin. Son olarak, damlacıkları okumaya başlamak için yazılımdaki oku düğmesine basın.
Her tahlildeki her konsantrasyon için bir intra tahlil ortalaması hesaplandı ve bu, tahlilin hassasiyetini ve doğruluğunu değerlendirmek için kullanıldı. Tüm QC seviyelerinde ortalama %7.7'lik bir tahliller arası hassasiyet ve %4.2'lik bir ortalama mutlak tahliller arası doğruluk bulundu. Tahliller arası doğruluk ve hassasiyet, her parti içindeki her bir QC seviyesinin tahliller arası ortalaması kullanılarak da hesaplanmıştır.
%4 ila %8,5 arasında değişen bir tahlil hassasiyeti ve bir ila %3,2 arasında değişen bir tahlil arası mutlak doğruluk bulunmuştur. Benzer şekilde, gözyaşı örneği için yüksek başak seviyesinde %3,7 ve düşük başak seviyesinde %12,2 ortalama tahliller arası hassasiyet ve yüksek seviyede %11,3 ve düşük seviyede %8,1 ortalama tahliller arası mutlak doğruluk gözlenmiştir. Tahliller arası hesaplamada, yüksek seviyede %5,5 ve düşük seviyede %7,1 hassasiyet ve yüksek seviyede %11,3 ve düşük seviyede %8,1 mutlak doğruluk bulunmuştur.
