ضع الحويصلة الجرثومية المعالجة بالإيتوبوسيد ، أو GV ، البويضات في أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المختلفة باستخدام المخزن المؤقت PFA-Tx 100 لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف البويضات في ثلاثة مخازن غسيل متميزة سعة 50 ميكرولترا في درجة حرارة الغرفة وضعها في 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت المانع على كتلة ساخنة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإعداد الجسم المضاد الأساسي الذي يتعرف على جاما H2AX.
قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي باستخدام المخزن المؤقت المانع بنسبة واحد إلى 200 واغمر البويضات في قطرات سعة 15 ميكرولتر عند أربع درجات مئوية طوال الليل. اغسل البويضات في ثلاثة مخازن غسيل مختلفة سعة 50 ميكرولتر. تحضير Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب ذات النمو المترافق.
بعد تخفيفه باستخدام المخزن المؤقت المانع ، اغمر البويضات في قطرات 15 ميكرولتر من الجسم المضاد لمدة ساعة واحدة على كتلة ساخنة 37 درجة مئوية محمية من الضوء. خذ صبغة الحمض النووي الفلورية الفلورية البعيدة DRAQ7 وانقل البويضات إليها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام قبل غسلها بثلاثة مخازن غسيل مختلفة. أضف قطرات صغيرة من المخزن المؤقت للغسيل إلى البويضات في طبق بتري ذو قاع زجاجي 35 ملم للفحص المجهري متحد البؤر.
قم بتشغيل وحدة التحكم بالليزر والليزر في النظام البؤري. بعد تشغيل وحدة التحكم في المجهر والمصابيح ، افتح البرنامج البؤري واختر عدسة الزيت 40X. ضع الطبق مع البويضات في حامل العينة وحاول التركيز على البويضات عن طريق تحريك المسرح على محاور X و Y و Z باستخدام عصا التحكم.
اضبط طاقة الليزر والكسب وحجم الثقب بشكل مستقل لكل تجربة لتقليل أي تشبع. لكل خلية بيضية، حدد منطقة الاهتمام تحديدا في النواة في منطقة الحمض النووي (DNA). حدد حدود منطقة الحمض النووي واضبط حجم الخطوة Z على ثلاثة ميكرومترات.
ثم ابدأ المسح. احفظ الصور لكل خلية في المجلد المحدد. افتح برنامج ImageJ وانقر على الصورة ، متبوعة بالألوان ، وتقسيم القنوات.
لتقسيم جميع القنوات. انقر فوق جدول البحث واختر الألوان المفضلة لكل قناة انقر فوق الصورة واللون ودمج القنوات لدمج قنوات gamma H2AX و DNA. في بويضات النواة المحاطة بمستويات عالية من تلف الحمض النووي ، انقر فوق الصورة ، والأكوام ، ومشروع Z ، وباستخدام أمر التحديدات اليدوية ، حدد منطقة الحمض النووي بأكملها.
انقر فوق تحليل ، متبوعا بقياس لقياس مضان جاما H2AX ونسخ القياسات في ملف Excel. يظهر مضان جاما H2AX في الخلايا البيضية في مرحلة النواة GV المحاطة بعد ساعة من علاج الإيتوبوسيد في هذا الشكل. يزداد جاما H2AX مباشرة بعد التعرض لجميع تركيزات الإيتوبوسيد ، وتعتمد الزيادة على التركيز.
يظهر هنا مضان جاما H2AX في بويضات مرحلة GV النواة المحيطة بعد 20 ساعة من علاج الإيتوبوسيد. يقلل Gamma H2AX بعد 20 ساعة من التعرض لجميع تركيزات الإيتوبوسيد. بعد توقف الطور المطول ، أظهرت بويضات مرحلة GV القدرة على تقليل عدد بؤر جاما H2AX وشدتها ، مما يعني وجود عمليات إصلاح نشطة في البويضات الموقوفة في مرحلة GV.