Plaats de controle- en met etoposide behandelde kiemblaasjes, of GV, eicellen in verschillende plastic weefselkweekschalen met PFA-Tx 100-buffer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de eicellen in drie verschillende wasbuffers van 50 microliter bij kamertemperatuur en plaats ze gedurende een uur in 25 microliter blokkerende buffer op een heet blok. Bereid vervolgens het primaire antilichaam voor dat gamma H2AX herkent.
Verdun het primaire antilichaam met de blokkerende buffer in een verhouding van één tot 200 en dompel de eicellen 's nachts onder in druppels van 15 microliter bij vier graden Celsius. Was de eicellen in drie verschillende wasbuffers van 50 microliter. Bereid het Alexa Fluor 488 geconjugeerde groei anti-konijn secundaire antilichaam voor.
Nadat u het hebt verdund met de blokkeringsbuffer, dompelt u de eicellen gedurende een uur onder in 15-microliterdruppels van het antilichaam op een 37 graden Celsius heet blok beschermd tegen licht. Neem een verrode fluorescerende DNA-kleurstof DRAQ7 en breng de eicellen er gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker in voordat je ze wast met drie verschillende wasbuffers. Voeg kleine druppels wasbuffer toe aan de eicellen in een petrischaal met glazen bodem van 35 millimeter voor confocale microscopie.
Schakel de lasercontroller en de lasers in het confocale systeem in. Nadat u de microscoopcontroller en de lampen hebt ingeschakeld, opent u de confocale software en kiest u de 40X-olielens. Plaats de schaal met de eicellen in de monsterhouder en probeer je te concentreren op de eicellen door het podium op X-, Y- en Z-assen te bewegen met behulp van de joystick.
Stel het laservermogen, de versterking en de pinhole-grootte onafhankelijk in voor elk experiment om eventuele verzadiging te minimaliseren. Stel voor elke eicel het interessegebied specifiek in de kern in het DNA-gebied in. Definieer de randen van het DNA-gebied en pas de grootte van de Z-stap aan tot drie micrometer.
Start vervolgens het scannen. Sla de afbeeldingen voor elke cel op in de geselecteerde map. Open de ImageJ-software en klik op afbeelding, gevolgd door kleur en gesplitste kanalen.
Om alle kanalen te splitsen. Klik op de opzoektabel en kies de voorkeurskleuren voor elk kanaal Klik op afbeelding, kleur en samenvoegkanalen om de kanalen voor gamma H2AX en DNA samen te voegen. Klik in de omringende nucleolus-eicellen met hoge niveaus van DNA-schade op afbeelding, stapels, Z-project en selecteer met het commando selecties uit de vrije hand het hele DNA-gebied.
Klik op analyseren, gevolgd door meten om de gamma H2AX fluorescentie te meten en de metingen te kopiëren naar een Excel bestand. De gamma H2AX fluorescentie in de omgeven nucleolus GV stadium eicellen nul uur na de etoposide behandeling is weergegeven in deze figuur. Het gamma H2AX neemt onmiddellijk na de blootstelling toe bij alle etoposideconcentraties en de toename is concentratieafhankelijk.
De gamma H2AX fluorescentie in de omgeven nucleolus GV stadium eicellen 20 uur na de etoposide behandeling wordt hier getoond. Gamma H2AX vermindert 20 uur na de blootstelling bij alle etoposideconcentraties. Na langdurige profasestilstand vertoonden de GV-stadium-eicellen de capaciteit om het aantal en de intensiteit van gamma H2AX-foci te verminderen, wat de aanwezigheid van actieve reparatieprocessen in de GV-fase gearresteerde eicellen impliceert.