Placez les ovocytes témoins et les ovocytes de la vésicule germinale traitée à l’étoposide, ou GV, dans différentes boîtes de culture tissulaire en plastique avec un tampon PFA-Tx 100 pendant 40 minutes à température ambiante. Rincez les ovocytes dans trois tampons de lavage distincts de 50 microlitres à température ambiante et placez-les dans 25 microlitres de tampon de blocage sur un bloc chaud pendant une heure. Ensuite, préparez l’anticorps primaire qui reconnaît le gamma H2AX.
Diluez l’anticorps primaire avec le tampon bloquant dans un rapport de un pour 200 et plongez les ovocytes dans des gouttes de 15 microlitres à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les ovocytes dans trois tampons de lavage différents de 50 microlitres. Préparez l’anticorps secondaire anti-lapin de croissance conjuguée Alexa Fluor 488.
Après l’avoir dilué avec le tampon bloquant, plongez les ovocytes dans des gouttes de 15 microlitres d’anticorps pendant une heure sur un bloc chaud à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière. Prenez un colorant d’ADN fluorescent rouge lointain DRAQ7 et transférez-y les ovocytes pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité avant de les laver avec trois tampons de lavage différents. Ajouter de petites gouttes de tampon de lavage aux ovocytes dans une boîte de Pétri à fond de verre de 35 millimètres pour la microscopie confocale.
Allumez le contrôleur laser et les lasers dans le système confocal. Après avoir allumé le contrôleur du microscope et les lampes, ouvrez le logiciel confocal et choisissez la lentille à huile 40X. Placez la boîte contenant les ovocytes dans le porte-échantillon et essayez de vous concentrer sur les ovocytes en déplaçant la platine sur les axes X, Y et Z à l’aide du joystick.
Réglez la puissance du laser, le gain et la taille du trou d’épingle indépendamment pour chaque expérience afin de minimiser toute saturation. Pour chaque ovocyte, définissez la zone d’intérêt spécifiquement dans le noyau au niveau de la zone de l’ADN. Définissez les limites de la zone de l’ADN et ajustez la taille de l’étape Z à trois micromètres.
Lancez ensuite l’analyse. Enregistrez les images de chaque cellule du dossier sélectionné. Ouvrez le logiciel ImageJ et cliquez sur image, puis sur la couleur et sur les canaux divisés.
Pour diviser tous les canaux. Cliquez sur la table de correspondance et choisissez les couleurs préférées pour chaque canal Cliquez sur image, colorez et fusionnez les canaux pour fusionner les canaux pour gamma H2AX et DNA. Dans les ovocytes nucléoles entourés avec des niveaux élevés de dommages à l’ADN, cliquez sur image, stacks, Z-project, et avec la commande de sélections à main levée, sélectionnez toute la zone d’ADN.
Cliquez sur analyser, puis sur mesurer pour mesurer la fluorescence gamma H2AX et copier les mesures dans un fichier Excel. La fluorescence gamma H2AX dans les ovocytes du stade GV nucléole entourés zéro heure après le traitement à l’étoposide est illustrée sur cette figure. Le gamma H2AX augmente immédiatement après l’exposition à toutes les concentrations d’étoposide, et l’augmentation dépend de la concentration.
La fluorescence gamma H2AX dans les ovocytes du stade GV du nucléole entouré, 20 heures après le traitement par étoposide, est montrée ici. Gamma H2AX réduit 20 heures après l’exposition à toutes les concentrations d’étoposide. Après un arrêt prolongé de la prophase, les ovocytes du stade GV ont montré la capacité de réduire le nombre et l’intensité des foyers gamma H2AX, ce qui implique la présence de processus de réparation actifs dans les ovocytes arrêtés au stade GV.
