Die Kontroll- und Etoposid-behandelten Keimvesikel (GV-Eizellen) werden 40 Minuten lang bei Raumtemperatur in verschiedene Kunststoff-Gewebekulturschalen mit PFA-Tx 100-Puffer gegeben. Spülen Sie die Eizellen in drei verschiedenen 50-Mikroliter-Waschpuffern bei Raumtemperatur aus und legen Sie sie eine Stunde lang in 25 Mikroliter Sperrpuffer auf einen heißen Block. Bereiten Sie als Nächstes den primären Antikörper vor, der Gamma H2AX erkennt.
Verdünnen Sie den primären Antikörper mit dem Blockierungspuffer im Verhältnis eins zu 200 und tauchen Sie die Eizellen über Nacht in 15-Mikroliter-Tropfen bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Eizellen in drei verschiedenen 50-Mikroliter-Waschpuffern. Bereiten Sie den Alexa Fluor 488 konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper vor.
Nach der Verdünnung mit dem Blockierungspuffer tauchen Sie die Eizellen eine Stunde lang in 15-Mikroliter-Tropfen des Antikörpers auf einen 37 Grad Celsius heißen Block, der vor Licht geschützt ist. Nehmen Sie einen dunkelrot fluoreszierenden DNA-Farbstoff DRAQ7 und übertragen Sie die Eizellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln darauf, bevor Sie sie mit drei verschiedenen Waschpuffern waschen. Geben Sie kleine Tropfen Waschpuffer in eine 35-Millimeter-Petrischale mit Glasboden für die konfokale Mikroskopie.
Schalten Sie den Lasercontroller und die Laser im konfokalen System ein. Öffnen Sie nach dem Einschalten des Mikroskop-Controllers und der Lampen die konfokale Software und wählen Sie die 40X-Öllinse. Legen Sie die Schale mit den Eizellen in den Probenhalter und versuchen Sie, sich auf die Eizellen zu konzentrieren, indem Sie den Tisch mit dem Joystick auf der X-, Y- und Z-Achse bewegen.
Stellen Sie die Laserleistung, die Verstärkung und die Pinhole-Größe für jedes Experiment unabhängig voneinander ein, um die Sättigung zu minimieren. Legen Sie für jede Eizelle den interessierenden Bereich speziell im Zellkern im DNA-Bereich fest. Definieren Sie die Grenzen des DNA-Bereichs und stellen Sie die Z-Schrittweite auf drei Mikrometer ein.
Starten Sie dann den Scanvorgang. Speichern Sie die Bilder für jede Zelle im ausgewählten Ordner. Öffnen Sie die ImageJ-Software und klicken Sie auf Bild, gefolgt von Farbe und geteilten Kanälen.
Um alle Kanäle aufzuteilen. Klicken Sie auf die Nachschlagetabelle und wählen Sie die bevorzugten Farben für jeden Kanal Klicken Sie auf Bild-, Farb- und Zusammenführungskanäle, um die Kanäle für Gamma, H2AX und DNA zusammenzuführen. Klicken Sie in den umgebenden Nukleolus-Eizellen mit hoher DNA-Schädigung auf Bild, Stapel, Z-Projekt und wählen Sie mit dem Freihandauswahlbefehl den gesamten DNA-Bereich aus.
Klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Messen, um die Gamma-H2AX-Fluoreszenz zu messen und die Messungen in eine Excel-Datei zu kopieren. Die Gamma-H2AX-Fluoreszenz in den umgebenden Nukleolus-GV-Stadien der Eizellen null Stunden nach der Etoposidbehandlung ist in dieser Abbildung dargestellt. Das Gamma H2AX steigt unmittelbar nach der Exposition bei allen Etoposid-Konzentrationen an, und der Anstieg ist konzentrationsabhängig.
Die Gamma-H2AX-Fluoreszenz in den umgebenden Nukleolus-GV-Stadien 20 Stunden nach der Etoposidbehandlung ist hier dargestellt. Gamma H2AX reduziert 20 Stunden nach der Exposition bei allen Etoposid-Konzentrationen. Nach einem langwierigen Prophasenarrest zeigten die Eizellen im GV-Stadium die Fähigkeit, die Anzahl und Intensität der Gamma-H2AX-Foci zu reduzieren, was auf das Vorhandensein aktiver Reparaturprozesse in den im GV-Stadium angehaltenen Eizellen hindeutet.
