Colocar os ovócitos de controle e de vesícula germinativa tratada com etoposídeo, ou VG, em diferentes placas de cultura de tecidos plásticos com tampão PFA-Tx 100 por 40 minutos à temperatura ambiente. Enxaguar os ovócitos em três tampões de lavagem distintos de 50 microlitros à temperatura ambiente e colocá-los em 25 microlitros de tampão de bloqueio em um bloco quente por uma hora. Em seguida, prepare o anticorpo primário que reconhece a gama H2AX.
Diluir o anticorpo primário com o tampão de bloqueio em uma proporção de um para 200 e imergir os ovócitos em gotas de 15 microlitros a quatro graus Celsius durante a noite. Lave os ovócitos em três tampões de lavagem diferentes de 50 microlitros. Prepare o anticorpo secundário anti-coelho de crescimento conjugado Alexa Fluor 488.
Depois de diluí-lo com o tampão de bloqueio, mergulhe os ovócitos em gotas de 15 microlitros do anticorpo por uma hora em um bloco quente de 37 graus Celsius protegido da luz. Pegue um corante de DNA fluorescente vermelho distante DRAQ7 e transfira os ovócitos para ele por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro antes de lavá-los com três tampões de lavagem diferentes. Adicione pequenas gotas de tampão de lavagem aos ovócitos em uma placa de Petri com fundo de vidro de 35 milímetros para microscopia confocal.
Ligue o controlador de laser e os lasers no sistema confocal. Depois de ligar o controlador do microscópio e as lâmpadas, abra o software confocal e escolha a lente de óleo 40X. Coloque o prato com os ovócitos no porta-espécimes e tente focar nos ovócitos movendo o estágio nos eixos X, Y e Z usando o joystick.
Defina a potência do laser, o ganho e o tamanho do orifício independentemente para cada experimento para minimizar qualquer saturação. Para cada ovócito, defina a área de interesse especificamente no núcleo na área do DNA. Defina as bordas da área do DNA e ajuste o tamanho do passo Z para três micrômetros.
Em seguida, inicie a digitalização. Salve as imagens para cada célula na pasta selecionada. Abra o software ImageJ e clique na imagem, seguida de cor e canais divididos.
Para dividir todos os canais. Clique na tabela de pesquisa e escolha as cores preferidas para cada canal Clique na imagem, cor e mescle canais para mesclar os canais para gama H2AX e DNA. Nos ovócitos nucleolus cercados com altos níveis de dano ao DNA, clique na imagem, pilhas, projeto Z, e com o comando seleções à mão livre, selecione toda a área do DNA.
Clique em analisar, seguido de medida para medir a fluorescência gama H2AX e copie as medições em um arquivo Excel. A fluorescência gama H2AX nos ovócitos circundados do estágio nucleolus GV zero horas após o tratamento com etoposídeo é mostrada nesta figura. O gama H2AX aumenta imediatamente após a exposição em todas as concentrações de etoposídeo, e o aumento é dependente da concentração.
A fluorescência gama H2AX nos ovócitos circundados do estágio nucleolus GV 20 horas após o tratamento com etoposídeo é mostrada aqui. Gama H2AX reduz 20 horas após a exposição em todas as concentrações de etoposídeo. Após parada profásica prolongada, os ovócitos em estágio GV mostraram capacidade de reduzir o número e a intensidade dos focos de H2AX gama, implicando na presença de processos ativos de reparo nos ovócitos presos no estágio GV.