Placera kontroll- och etoposidbehandlade germinalvesikel, eller GV, oocyter i olika plastvävnadsodlingsskålar med PFA-Tx 100-buffert i 40 minuter vid rumstemperatur. Skölj äggcellerna i tre olika 50-mikroliters tvättbuffertar i rumstemperatur och placera dem i 25 mikroliter blockeringsbuffert på ett hett block i en timme. Förbered sedan den primära antikroppen som känner igen gamma H2AX.
Späd den primära antikroppen med den blockerande bufferten i förhållandet ett till 200 och sänk ner oocyterna i 15-mikrolitersdroppar vid fyra grader Celsius över natten. Tvätta äggcellerna i tre olika 50-liters tvättbuffertar. Förbered Alexa Fluor 488 konjugerad anti-kanin sekundär antikropp.
Efter att ha spätt ut den med den blockerande bufferten, sänk ner oocyterna i 15-mikrolitersdroppar av antikroppen i en timme på ett 37 grader Celsius varmt block skyddat från ljus. Ta ett långt rött fluorescerande DNA-färgämne DRAQ7 och överför oocyterna till det i 10 minuter i rumstemperatur i mörker innan du tvättar dem med tre olika tvättbuffertar. Tillsätt små droppar tvättbuffert till oocyterna i en 35 millimeters petriskål med glasbotten för konfokalmikroskopi.
Slå på laserstyrenheten och lasrarna i konfokalsystemet. Efter att ha slagit på mikroskopkontrollen och lamps, öppna konfokalprogramvaran och välj 40X oljelinsen. Placera skålen med oocyterna i provhållaren och försök att fokusera på oocyterna genom att flytta stage på X-, Y- och Z-axlarna med joysticken.
Ställ in lasereffekten, förstärkningen och nålhålsstorleken oberoende av varandra för varje experiment för att minimera eventuell mättnad. För varje oocyt, ställ in intresseområdet specifikt i kärnan vid DNA-området. Definiera gränserna för DNA-området och justera Z-stegsstorleken till tre mikrometer.
Starta sedan skanningen. Spara bilderna för varje cell i den valda mappen. Öppna programvaran ImageJ och klicka på bild, följt av färg och delade kanaler.
För att dela upp alla kanaler. Klicka på uppslagstabellen och välj önskade färger för varje kanal Klicka på bild, färg och slå samman kanaler för att slå samman kanalerna för gamma H2AX och DNA. I de omgivna nukleoloocyterna med höga nivåer av DNA-skador, klicka på bilden, staplarna, Z-projektet, och med kommandot för frihandsval väljer du hela DNA-området.
Klicka på analysera, följt av mät för att mäta gamma H2AX-fluorescensen och kopiera mätningarna till en Excel-fil. Gamma H2AX-fluorescensen i de omgivna nukleolerna i GV-stadiet noll timmar efter etoposidbehandlingen visas i denna figur. Gamma H2AX ökar omedelbart efter exponeringen vid alla etoposidkoncentrationer, och ökningen är koncentrationsberoende.
Gamma H2AX-fluorescensen i de omgivna nukleol-GV-oocyterna 20 timmar efter etoposidbehandling visas här. Gamma H2AX reducerar 20 timmar efter exponeringen vid alla etoposidkoncentrationer. Efter utdraget profasstopp visade GV-oocyterna förmåga att minska antalet och intensiteten av gamma H2AX-härdar, vilket tyder på närvaron av aktiva reparationsprocesser i de GV-fasblockerade oocyterna.