Forbered to keramiske perler rør ved at fylde et to milliliter PCR-rør med et ca. 200 mikroliter rør fuld af 1,4 millimeter keramiske perler og mærk røret i overensstemmelse hermed, før du overfører dem inde i den sterile hætte. Tilsæt det anbefalede volumen lysisbuffer, der leveres i RNA-ekstraktionssættet, til det mærkede PCR-rør. Få cirka en tre millimeter terning fra hjerneprøven bekræftet med rabiesinfektion ved hjælp af en træapplikator og læg den i et mærket rør med prøve-id og 100 mikroliter nukleasefrit vand i røret mærket negativ kontrol.
Forstyrre hjernevævet manuelt ved hjælp af en træapplikatorpind og derefter hvirvel med maksimal hastighed, indtil fuldstændig vævshomogenisering er opnået. Derefter centrifugeres det homogeniserede lysat. Supernatanten overføres til et nyligt mærket mikrocentrifugerør ved hjælp af en pipette og bruges til yderligere RNA-ekstraktionstrin, CDNA-forberedelse og PCR-amplifikation.
Efter CDNA-forberedelse og PCR-amplifikation ved hjælp af primerpuljer A og B skal du udføre PCR-oprydning og kvantificering i post-PCR-området. Aliquot SPRI perler i mikrocentrifugerør fra hovedflasken. Disse kan også udarbejdes på forhånd.
Opbevar rørene ved fire grader celsius, eller opbevar dem i et koldt stativ eller is. Derefter opvarmes SPRI-perlen ved ca. 20 grader Celsius og hvirvles grundigt for at genophænge perlerne i hele opløsningen. Derefter kombineres primerpulje A og primerpulje B PCR-produkter i 1,5 ml-rørene for hver prøve.
Tilsæt vand for at bringe volumen til 25 mikroliter, hvis det kræves, før du tilføjer 25 mikroliter SPRI-perler til hvert kombineret produkt og blander det. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10 minutter med lejlighedsvis invertering eller svirpning af rørene. Placer derefter rørene på et magnetisk stativ indtil adskillelsen af perler og opløsning.
Når det er gjort, kasseres supernatanten uden at forstyrre perlepellet. Giv derefter to vaske på 30 sekunder med frisklavet 200 mikroliter 80% ethanol og kassér ethanolen. Efter den anden vask fjernes alle spor af ethanol ved hjælp af en 10 mikroliter pipettespids.
Lufttør pelleten, indtil spor af ethanol er fordampet, og pelleten skifter fra skinnende til mat. Re-suspender perlerne i 15 mikroliter nukleasefrit vand for at genvinde det rensede DNA-produkt og inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter. Adskil perlerne fra opløsningen på et magnetisk stativ.
Efter overførsel af supernatanten til et frisk glas på 1,5 ml fremstilles en fortynding på en til 10 ml af hver prøve i nukleasefrit vand. DNA-koncentrationen af hver fortyndet prøve måles med et meget følsomt og specifikt fluorimeter efter producentens anvisninger.