Préparez deux tubes de billes de céramique en remplissant un tube PCR de deux millilitres avec un tube d’environ 200 microlitres rempli de billes de céramique de 1,4 millimètre et étiquetez le tube en conséquence avant de les transférer à l’intérieur de la hotte stérile. Ajoutez le volume recommandé de tampon de lyse fourni dans le kit d’extraction d’ARN dans le tube PCR étiqueté. Prélevez un cube d’environ trois millimètres de l’échantillon de cerveau confirmé avec une infection par la rage à l’aide d’un applicateur en bois et mettez-le dans un tube étiqueté avec l’identification de l’échantillon et 100 microlitres d’eau sans nucléase dans le tube étiqueté témoin négatif.
Perturbez manuellement le tissu cérébral à l’aide d’un bâtonnet applicateur en bois, puis tourbillonnez à la vitesse maximale jusqu’à ce que l’homogénéisation complète des tissus soit atteinte. Ensuite, centrifugez le lysat homogénéisé. Transférez le surnageant dans un tube à micro-centrifuger nouvellement marqué à l’aide d’une pipette et utilisez-le pour d’autres étapes d’extraction de l’ARN, de préparation de l’ADNC et d’amplification par PCR.
Après la préparation de l’ADNC et l’amplification de la PCR à l’aide des pools d’amorces A et B, effectuez le nettoyage et la quantification de la PCR dans la zone post-PCR. Aliquote SPRI perle dans des microtubes à centrifuger à partir de la bouteille principale. Ceux-ci peuvent également être préparés à l’avance.
Conservez les tubes à quatre degrés Celsius ou conservez-les dans une grille froide ou de la glace. Ensuite, réchauffez l’aliquote de billes SPRI à environ 20 degrés Celsius et faites un vortex complet pour remettre les billes en suspension dans toute la solution. Ensuite, dans les tubes de 1,5 millilitre, combinez les produits PCR du pool d’amorces A et du pool d’amorces B pour chaque échantillon.
Ajouter de l’eau pour porter le volume à 25 microlitres si nécessaire avant d’ajouter 25 microlitres de billes SPRI à chaque produit combiné et de le mélanger. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes en inversant ou en faisant tourner les tubes de temps en temps. Ensuite, placez les tubes sur une grille magnétique jusqu’à la séparation des billes et de la solution.
Une fois cela fait, jetez le surnageant sans déranger la pastille de bille. Ensuite, faites deux lavages de 30 secondes avec 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparés et jetez l’éthanol. Après le deuxième lavage, éliminez toute trace d’éthanol à l’aide d’un embout pipette de 10 microlitres.
Séchez la pastille à l’air libre jusqu’à ce que l’éthanol à l’état de trace se soit évaporé et que la pastille passe de brillante à mate. Remettre les billes en suspension dans 15 microlitres d’eau sans nucléase pour récupérer le produit d’ADN nettoyé et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Séparez les billes de la solution sur une grille magnétique.
Après avoir transféré le surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre, préparez une dilution d’un à 10 de chaque échantillon dans de l’eau sans nucléase. Mesurez la concentration d’ADN de chaque échantillon dilué à l’aide d’un fluorimètre très sensible et spécifique, en suivant les instructions du fabricant.
