Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

הכינו שני צינורות חרוזים קרמיים על ידי מילוי צינור PCR של שני מיליליטר בצינור מיקרוליטר בגודל של כ-200 מיקרוליטר מלא בחרוזים קרמיים בקוטר 1.4 מילימטר ותייגו את הצינור בהתאם לפני העברתם לתוך מכסה המנוע הסטרילי. הוסף את הנפח המומלץ של חיץ ליזיס המסופק בערכת מיצוי ה- RNA לצינור ה- PCR המסומן. קבל בערך קובייה של שלושה מילימטר מדגימת המוח שאושרה עם זיהום כלבת באמצעות אפליקטור עץ והכנס אותה לצינור מסומן עם מזהה דגימה ו -100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז לתוך הצינור המסומן בקרה שלילית.

לשבש את רקמת המוח באופן ידני באמצעות מקל אפליקטור עץ ולאחר מכן מערבלים במהירות מקסימלית עד הומוגניזציה מלאה של הרקמה מושגת. לאחר מכן, צנטריפוגה הליזט הומוגני. העבירו את הסופרנאטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש באמצעות פיפטה והשתמשו בו לשלבי מיצוי RNA נוספים, הכנת CDNA והגברת PCR.

לאחר הכנת CDNA והגברת PCR באמצעות מאגרי פריימר A ו-B, יש לבצע ניקוי וכימות PCR באזור פוסט PCR. Aliquot SPRI חרוזים לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות מהבקבוק הראשי. ניתן גם להכין אותם מראש.

אחסנו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס או שמרו אותם במדף קר או קרח. לאחר מכן, לחמם את aliquot חרוז SPRI ב 20 מעלות צלזיוס כ 20 מעלות צלזיוס היטב מערבולת כדי להשעות מחדש את החרוזים בתמיסה כולה. לאחר מכן בצינורות 1.5 מיליליטר, לשלב את מאגר פריימר A ופריימר בריכה B מוצרי PCR עבור כל דגימה.

הוסיפו מים כדי להביא את הנפח ל-25 מיקרוליטר במידת הצורך לפני הוספת 25 מיקרוליטר חרוזי SPRI לכל מוצר משולב וערבובו. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם היפוך או הבהוב מדי פעם של הצינורות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על מדף מגנטי עד להפרדת חרוזים ותמיסה.

לאחר שתסיים, השליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לגלולת החרוזים. לאחר מכן תן שתי שטיפות של 30 שניות באמצעות מוכן טרי 200 מיקרוליטר של 80% אתנול ולהשליך את האתנול. לאחר השטיפה השנייה, להסיר את כל עקבות אתנול באמצעות קצה פיפטה 10 מיקרוליטר.

יש לייבש את הגלולה באוויר עד שעקבות אתנול מתאדים והגלולה משתנה מבריקה למט. השהה מחדש את החרוזים ב -15 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז כדי לשחזר את מוצר ה- DNA הנקי ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפרד את החרוזים מהתמיסה על מדף מגנטי.

לאחר העברת הסופרנאטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר, הכינו דילול של אחד עד 10 מכל דגימה במים נטולי נוקלאז. יש למדוד את ריכוז הדנ"א של כל דגימה מדוללת באמצעות פלואורימטר רגיש וספציפי במיוחד, בהתאם להוראות היצרן.