Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

2ミリリットルのPCRチューブに1.4ミリメートルのセラミックビーズを充填した約200マイクロリットルのチューブを充填して2本のセラミックビーズチューブを調製し、チューブにラベルを付けてから滅菌フード内に移します。RNA抽出キットに同梱されている推奨容量の溶解バッファーを標識PCRチューブに加えます。木製のアプリケーターを使用して狂犬病感染が確認された脳サンプルから約3ミリメートルの立方体を取り出し、サンプルIDと100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をネガティブコントロールとラベル付けされたチューブに入れます。

木製のアプリケータースティックを使用して脳組織を手動で破壊し、組織の完全な均質化が達成されるまで最高速度でボルテックスします。次に、均質化したライセートを遠心分離します。上清をピペットを使用して新しく標識したマイクロ遠心チューブに移し、さらなるRNA抽出ステップ、CDNA調製、およびPCR増幅に使用します。

プライマープールAおよびBを用いたCDNA調製およびPCR増幅後、PCR後の領域でPCRクリーンアップおよび定量を行います。メインボトルからマイクロ遠心チューブにSPRIビーズを分注します。これらも事前に準備できます。

チューブは摂氏4度で保管するか、冷たいラックまたは氷に保管してください。次に、SPRIビーズアリコートを摂氏約20度で温め、十分にボルテックスして溶液全体にビーズを再懸濁します。次に、1.5ミリリットルのチューブで、各サンプルのプライマープールAとプライマープールBのPCR産物を組み合わせます。

必要に応じて水を加えて容量を25マイクロリットルにしてから、組み合わせた各製品に25マイクロリットルのSPRIビーズを加えて混合します。混合物を室温で10分間インキュベートし、時々チューブを反転またはフリックします。次に、ビーズと溶液が分離するまでチューブを磁気ラックに置きます。

完了したら、ビーズペレットを乱さずに上澄みを捨てます。次に、新たに調製した200マイクロリットルの80%エタノールを使用して30秒間の洗浄を2回行い、エタノールを廃棄します。2回目の洗浄後、10マイクロリットルのピペットチップを使用してエタノールの痕跡をすべて取り除きます。

微量のエタノールが蒸発し、ペレットが光沢のあるマットな状態に変わるまで、ペレットを風乾します。ビーズを15マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、洗浄したDNA産物を回収し、室温で10分間インキュベートします。磁気ラック上の溶液からビーズを分離します。

上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移した後、各サンプルをヌクレアーゼフリー水で1〜10倍に希釈して調製します。希釈した各サンプルのDNA濃度を、メーカーの指示に従って、高感度で特異的な蛍光度計で測定します。