Forbered to keramiske perlerør ved å fylle et to milliliter PCR-rør med et omtrent 200 mikroliter rør fullt av 1,4 millimeter keramiske perler og merk røret tilsvarende før du overfører dem inne i den sterile hetten. Legg til det anbefalte volumet av lysisbuffer som følger med i RNA-ekstraksjonssettet til det merkede PCR-røret. Få omtrent en tre millimeter kube fra hjerneprøven bekreftet med rabiesinfeksjon ved hjelp av en treapplikator og legg den inn i et merket rør med prøve-ID og 100 mikroliter nukleasefritt vann inn i røret merket negativ kontroll.
Forstyrr hjernevevet manuelt ved hjelp av en applikatorpinne av tre og deretter virvel med maksimal hastighet til fullstendig vevshomogenisering oppnås. Deretter sentrifugerer det homogeniserte lysatet. Overfør supernatanten til et nylig merket mikrosentrifugerør ved hjelp av en pipette og bruk den til ytterligere RNA-ekstraksjonstrinn, CDNA-forberedelse og PCR-amplifikasjon.
Etter CDNA-preparatet og PCR-amplifikasjonen ved bruk av primerbasseng A og B, utfør PCR-opprydding og kvantifisering i post-PCR-området. Aliquot SPRI perler inn i mikrosentrifugerør fra hovedflasken. Disse kan også forberedes på forhånd.
Oppbevar rørene ved fire grader celsius eller oppbevar dem i et kaldt stativ eller is. Varm deretter PRI-perlealikoten ved ca. 20 grader Celsius og virvel grundig for å suspendere perlene i hele løsningen. Deretter kombinerer du primerbassenget A og primerpool B PCR-produktene i 1,5 milliliters rørene for hver prøve.
Tilsett vann for å bringe volumet til 25 mikroliter om nødvendig før du tilsetter 25 mikroliter SPRI-perler til hvert kombinert produkt og blander det. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 minutter med sporadisk invertering eller flikking av rørene. Deretter plasserer du rørene på et magnetisk stativ til separasjonen av perler og løsning.
Når du er ferdig, kast supernatanten uten å forstyrre perlepelleten. Vask deretter to vasker på 30 sekunder med nytilberedt 200 mikroliter 80% etanol og kast etanolen. Etter den andre vasken, fjern alle spor av etanol ved hjelp av en 10 mikroliter pipettespiss.
Lufttørk pelleten til sporetanol har fordampet og pelleten skifter fra blank til matt. Heng kulene på nytt i 15 mikroliter nukleasefritt vann for å gjenvinne det rensede DNA-produktet og inkubere ved romtemperatur i 10 minutter. Separer perlene fra løsningen på et magnetisk stativ.
Etter overføring av supernatanten til et friskt 1,5 milliliter rør, lag en til 10 fortynning av hver prøve i nukleasefritt vann. Mål DNA-konsentrasjonen av hver fortynnet prøve med et svært følsomt og spesifikt fluorimeter, i henhold til produsentens instruksjoner.