Prepare dos tubos de perlas de cerámica llenando un tubo de PCR de dos mililitros con un tubo de aproximadamente 200 microlitros lleno de perlas de cerámica de 1,4 milímetros y etiquete el tubo en consecuencia antes de transferirlos dentro de la campana estéril. Agregue el volumen recomendado de tampón de lisis proporcionado en el kit de extracción de ARN al tubo de PCR etiquetado. Obtenga aproximadamente un cubo de tres milímetros de la muestra de cerebro confirmada con infección de rabia usando un aplicador de madera y colóquelo en un tubo etiquetado con la identificación de la muestra y 100 microlitros de agua libre de nucleasa en el tubo etiquetado como control negativo.
Altere el tejido cerebral manualmente con un palo aplicador de madera y luego haga un vórtice a máxima velocidad hasta lograr la homogeneización completa del tejido. A continuación, centrifugar el lisado homogeneizado. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga recién marcado con una pipeta y utilícelo para otros pasos de extracción de ARN, preparación de CDNA y amplificación por PCR.
Después de la preparación del ADNc y la amplificación por PCR utilizando los grupos de cebadores A y B, realice la limpieza y cuantificación por PCR en el área posterior a la PCR. Alícuota SPRI se introduce en tubos de microcentrífuga desde la botella principal. Estos también se pueden preparar con anticipación.
Guarde los tubos a cuatro grados centígrados o guárdelos en una rejilla fría o hielo. A continuación, caliente la alícuota de la perla SPRI a aproximadamente 20 grados centígrados y haga un vórtice completo para volver a suspender las perlas en toda la solución. Luego, en los tubos de 1,5 mililitros, combine los productos de PCR del grupo de cebadores A y B del grupo de cebadores para cada muestra.
Agregue agua para llevar el volumen a 25 microlitros si es necesario antes de agregar 25 microlitros de perlas SPRI a cada producto combinado y mezclarlo. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos con la inversión o el movimiento ocasional de los tubos. A continuación, coloque los tubos en una rejilla magnética hasta la separación de las perlas y la solución.
Una vez hecho esto, deseche el sobrenadante sin alterar la bolita de perlas. Luego dar dos lavados de 30 segundos con 200 microlitros recién preparados de etanol al 80% y desechar el etanol. Después del segundo lavado, elimine todos los restos de etanol con una punta de pipeta de 10 microlitros.
Seque al aire el gránulo hasta que el etanol traza se haya evaporado y el gránulo cambie de brillante a mate. Vuelva a suspender las perlas en 15 microlitros de agua libre de nucleasas para recuperar el producto de ADN limpio e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Separe las perlas de la solución en una rejilla magnética.
Después de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros, prepare una dilución de una a 10 de cada muestra en agua libre de nucleasa. Mida la concentración de ADN de cada muestra diluida con un fluorímetro altamente sensible y específico, siguiendo las instrucciones del fabricante.