Förbered två keramiska pärlor genom att fylla ett två milliliter PCR-rör med ett cirka 200 mikroliters rör fullt med 1.4 millimeter keramiska pärlor och märk röret därefter innan du överför dem in i den sterila huven. Tillsätt den rekommenderade volymen lysbuffert som finns i RNA-extraktionssatsen till det märkta PCR-röret. Ta ungefär en tre millimeters kub från hjärnprovet som bekräftats med rabiesinfektion med hjälp av en träapplikator och lägg den i ett märkt rör med prov-ID och 100 mikroliter nukleasfritt vatten i röret märkt negativ kontroll.
Stör hjärnvävnaden manuellt med hjälp av en applikatorpinne av trä och virvla sedan med maximal hastighet tills fullständig vävnadshomogenisering uppnås. Centrifugera sedan det homogeniserade lysatet. Överför supernatanten till ett nyligen märkt mikrocentrifugrör med hjälp av en pipett och använd den för ytterligare RNA-extraktionssteg, CDNA-beredning och PCR-amplifiering.
Efter CDNA-beredningen och PCR-amplifieringen med hjälp av primerpoolerna A och B, utför PCR-sanering och kvantifiering i området efter PCR. Alikvot SPRI pärlas in i mikrocentrifugrör från huvudflaskan. Dessa kan också förberedas i förväg.
Förvara rören i fyra grader eller förvara dem i ett kallt ställ eller is. Värm sedan SPRI-pärlans alikvot vid cirka 20 grader Celsius och virvla ordentligt för att återsuspendera pärlorna i hela lösningen. Kombinera sedan primerpool A och primerpool B PCR-produkterna i 1,5 ml-rören för varje prov.
Tillsätt vatten för att få volymen till 25 mikroliter om det behövs innan du tillsätter 25 mikroliter SPRI-pärlor till varje kombinerad produkt och blandar den. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 10 minuter med enstaka uppochnedvända eller snärtande av rören. Placera sedan rören på ett magnetiskt ställ tills pärlorna och lösningen separeras.
När du är klar, kassera supernatanten utan att störa pärlpelleten. Tvätta sedan två gånger i 30 sekunder med nyberedd 200 mikroliter 80 % etanol och kassera etanolen. Efter den andra tvätten, ta bort alla spår av etanol med en 10 mikroliters pipettspets.
Lufttorka pelleten tills spåretanol har avdunstat och pelleten ändras från blank till matt. Häng upp pärlorna i 15 mikroliter nukleasfritt vatten för att återvinna den rengjorda DNA-produkten och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter. Separera pärlorna från lösningen på ett magnetiskt ställ.
Efter att ha överfört supernatanten till ett färskt 1,5 ml-rör, förbered en utspädning på 1 till 10 av varje prov i nukleasfritt vatten. Mät DNA-koncentrationen i varje utspätt prov med en mycket känslig och specifik fluorimeter, enligt tillverkarens instruktioner.