通过向后翻转测序装置盖并顺时针滑动灌注端口盖,开始灌注和加载质量检查的流通池,可视化灌注端口。要去除气泡,请将 P 1000 移液器设置为 200 微升,然后将移液器吸头垂直插入灌注口。转动方向盘,直到看到进入移液器吸头的少量体积。
通过灌注端口将 800 微升预制的流通池灌注混合物装入流通池中,以避免引入气泡。提起样品端口盖,通过灌注端口将 200 微升剩余的灌注混合物装入流通池。为确保上样微珠的混合,通过移液和滴液将 75 微升液重新悬浮到流通池中,通过样品端口重悬文库预混液。
轻轻更换样品端口盖,确保塞子进入样品端口。关闭启动端口并盖上测序装置盖。对于实时基础呼叫,请使用 Rampart。
使用 Arctic RabV 环境,并在为 Rampart 输出创建的目录中工作。然后键入 Rampart 命令以导航到所需的路径。首先是 Rampart 特定的方案协议,接下来的 base 称为 path,即 mino fastq 传递输出文件夹进行运行。
打开浏览器窗口并导航到 URL 框中的本地主机 3000。等待足够的数据被基调用,然后结果才会出现在屏幕上。前三个面板显示了整个运行的汇总图。
图一显示了索引参考基因组上每个核苷酸位置的每个条形码的映射读长覆盖深度。图二显示一段时间内所有条码的映射读取,图三显示每个条码的映射读取。下方面板显示每个条形码的绘图行。
左图显示了索引参考基因组上每个核苷酸位置的映射reads的覆盖深度。映射读取的长度分布位于中间。在右上角可以看到索引参考基因组上核苷酸位置的比例,随着时间的推移获得 10 倍、100 倍和 1000 倍的映射读段覆盖率。
对于共识序列的谱系分配,请使用 MadDog。从 GitHub 拉取 MadDog 存储库,以确保使用最新版本。在之前创建的本地 MadDog 存储库中创建一个文件夹。
在文件夹中,添加包含共识序列的 fastA 文件。此外,将元数据文件添加到文件夹中。确保此文件是 CSV,其中包含四列,分别称为 ID、国家/地区、年份和分配。
从 GitHub 拉取 MadDog 存储库,以确保使用最新版本。在命令行界面中,使用 conda activate MADDOG 命令激活 conda 环境。在命令行界面中,导航到 MadDog 存储库文件夹。
首先,对序列进行谱系分配,以检查潜在的异常,并通过运行 sh 分配来确定运行较长的谱系指定步骤是否合适。sh 命令。出现提示时,输入 Y 以确认存储库已拉取并使用 MadDog 的最新版本。
出现提示时,输入包含 MadDog 存储库中 fastA 文件的文件夹名称。世系分配完成后,检查文件夹中的输出文件。如果输出符合预期,并且将多个序列分配给同一谱系,则运行谱系指定。
运行世系指定时,删除刚刚创建的分配输出文件。在 MadDog 存储库文件夹内的终端中,运行命令 sh designation.sh。出现提示时,输入 Y 以指示已拉取存储库,并且正在使用最新版本的 MadDog 完成工作。
出现提示时,在包含 fastA 文件和元数据的 MadDog 存储库文件夹中输入文件夹名称。狂犬病病毒RABV的样本测序到解释工作流程已成功用于坦桑尼亚、肯尼亚、尼日利亚和菲律宾等流行国家的不同实验室条件。使用 Rampart 的实时基础调用显示了读取的实时生成和每个样本的覆盖率百分比。
用于编译和解释所得 RABV 序列的谱系分类和命名系统 MadDog 显示,在 MadDog 分配后,局部谱系的分类分辨率更高。