Commencez l’amorçage et le chargement de la cellule d’écoulement à qualité contrôlée en retournant le couvercle du dispositif de séquençage et en faisant glisser le couvercle de l’orifice d’amorçage dans le sens des aiguilles d’une montre, en visualisant l’orifice d’amorçage. Pour éliminer les bulles d’air, réglez une pipette P 1000 sur 200 microlitres et insérez l’embout de la pipette verticalement dans l’orifice d’amorçage. Tournez la molette jusqu’à ce qu’un petit volume entrant dans la pointe de la pipette soit visible.
Chargez 800 microlitres de mélange d’amorçage de cellule d’écoulement pré-préparé dans la cellule d’écoulement via l’orifice d’amorçage pour éviter d’introduire des bulles. Soulevez le couvercle de l’orifice d’échantillonnage et chargez 200 microlitres du mélange d’amorçage restant dans la cellule d’écoulement via l’orifice d’amorçage. Pour assurer le mélange des billes de chargement, remettre en suspension le mélange maître de la bibliothèque par pipetage et, goutte à goutte, charger 75 microlitres dans la cellule d’écoulement via l’orifice d’échantillonnage.
Replacez doucement le couvercle de l’orifice d’échantillonnage en veillant à ce que la bonde pénètre dans l’orifice d’échantillonnage. Fermez l’orifice d’amorçage et replacez le couvercle du dispositif de séquençage. Pour les appels de base en direct, utilisez Rampart.
Utilisez l’environnement Arctic RabV et travaillez dans le répertoire créé pour la sortie Rampart. Tapez ensuite la commande Rempart pour accéder aux chemins requis. Tout d’abord, le protocole de schéma spécifique à Rampart, et ensuite la base appelée path, le dossier de sortie mino fastq pass pour l’exécution.
Ouvrez une fenêtre de navigateur et accédez à l’hôte local 3000 dans la zone URL. Attendez que suffisamment de données soient appelées à la base avant que les résultats n’apparaissent à l’écran. Les trois panneaux supérieurs affichent des graphiques récapitulatifs pour l’ensemble de l’exécution.
Le premier graphique montre la profondeur de couverture des lectures cartographiées pour chaque code-barres par position nucléotidique sur le génome de référence de l’index. Le deuxième graphique montre les lectures mappées de tous les codes-barres au fil du temps, et le graphique trois montre les lectures mappées par code-barres. Les panneaux inférieurs affichent les rangées de tracés par code-barres.
La partie gauche montre la profondeur de couverture des lectures cartographiées par position nucléotidique sur le génome de référence de l’index. La distribution de longueur des lectures mappées se situe au milieu. La proportion de positions de nucléotides sur le génome de référence de l’indice obtenant une couverture de 10x, 100x et 1000x des lectures cartographiées au fil du temps est visible dans le coin droit.
Pour l’affectation de lignées de séquences de consensus, utilisez MadDog. Extrayez le dépôt MadDog de GitHub pour vous assurer de travailler avec la dernière version. Créez un dossier dans le référentiel MadDog local précédemment créé.
À l’intérieur du dossier, ajoutez le fichier fastA contenant les séquences de consensus. Ajoutez également un fichier de métadonnées au dossier. Assurez-vous que ce fichier est au format CSV avec quatre colonnes intitulées ID, pays, année et affectation.
Extrayez le dépôt MadDog de GitHub pour vous assurer de travailler avec la dernière version. Dans l’interface de ligne de commande, activez l’environnement conda à l’aide d’une commande conda activate MADDOG. Dans l’interface de ligne de commande, accédez au dossier du référentiel MadDog.
Tout d’abord, effectuez une affectation de lignage sur des séquences pour vérifier les anomalies potentielles et identifier si l’exécution de l’étape de désignation de lignage la plus longue est appropriée en exécutant l’affectation sh. sh. Lorsque vous y êtes invité, entrez Y pour confirmer que le dépôt est extrait et fonctionne avec la dernière version de MadDog.
Lorsque vous y êtes invité, entrez le nom du dossier contenant le fichier fastA dans le référentiel MadDog. Une fois l’affectation de lignage terminée, vérifiez le fichier de sortie dans le dossier. Si la sortie est conforme aux attentes et que plusieurs séquences sont affectées à la même lignée, exécutez la désignation de lignage.
Lors de l’exécution de la désignation de lignage, supprimez le fichier de sortie d’affectation que vous venez de créer. Dans le terminal à l’intérieur du dossier du référentiel MadDog, exécutez la commande sh designation.sh. Lorsque vous y êtes invité, entrez Y pour indiquer que le dépôt est extrait et que le travail est effectué avec la version la plus récente de MadDog.
Lorsque vous y êtes invité, entrez le nom du dossier dans le dossier du référentiel MadDog contenant le fichier fastA et les métadonnées. Le flux de travail de l’échantillon à séquencer pour l’interprétation du virus de la rage a été utilisé avec succès dans différentes conditions de laboratoire dans des pays endémiques tels que la Tanzanie, le Kenya, le Nigeria et les Philippines. L’appel de base en direct à l’aide de Rampart a montré la génération en temps réel des lectures et le pourcentage de couverture par échantillon.
Un système de classification et de nomenclature des lignées, MadDog, utilisé pour compiler et interpréter les séquences RABV résultantes, a montré la classification à plus haute résolution des lignées locales après l’affectation de MadDog.