प्राइमिंग शुरू करें और अनुक्रमण डिवाइस ढक्कन को वापस फ़्लिप करके गुणवत्ता की जाँच प्रवाह सेल लोड हो रहा है और प्राइमिंग पोर्ट कवर को दक्षिणावर्त स्लाइड करके, प्राइमिंग पोर्ट की कल्पना करें। हवा बुलबुले को दूर करने के लिए, 200 microliters के लिए एक पी 1000 विंदुक सेट और भड़काना बंदरगाह में खड़ी विंदुक टिप डालें. पहिया बारी जब तक एक छोटी मात्रा विंदुक टिप में प्रवेश देखा जाता है.
बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए प्राइमिंग पोर्ट के माध्यम से प्रवाह सेल में पूर्व-तैयार प्रवाह सेल प्राइमिंग मिश्रण के 800 माइक्रोलीटर लोड करें। नमूना पोर्ट कवर लिफ्ट और प्राइमिंग पोर्ट के माध्यम से प्रवाह सेल में शेष भड़काना मिश्रण के 200 microliters लोड. लोडिंग मोतियों के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए, लाइब्रेरी मास्टर मिक्स को पाइपिंग और ड्रॉपवाइज द्वारा फिर से निलंबित करें, नमूना पोर्ट के माध्यम से प्रवाह सेल में 75 माइक्रोलीटर लोड करें।
नमूना पोर्ट कवर को धीरे से बदलें सुनिश्चित करें कि बंग नमूना पोर्ट में प्रवेश करता है। प्राइमिंग पोर्ट को बंद करें और अनुक्रमण डिवाइस ढक्कन को बदलें। लाइव बेस कॉलिंग के लिए, रैंपर्ट का उपयोग करें।
आर्कटिक आरएबीवी पर्यावरण का उपयोग करें और रैंपर्ट आउटपुट के लिए बनाई गई निर्देशिका में काम करें। फिर आवश्यक पथों पर नेविगेट करने के लिए रैंपर्ट कमांड टाइप करें। सबसे पहले, रैंपर्ट विशिष्ट योजना प्रोटोकॉल, और अगला आधार जिसे पथ कहा जाता है, रन के लिए मिनो फास्टक्यू पास आउटपुट फ़ोल्डर।
एक ब्राउज़र विंडो खोलें और URL बॉक्स में स्थानीय होस्ट 3000 पर नेविगेट करें। स्क्रीन पर परिणाम दिखाई देने से पहले पर्याप्त डेटा के आधार पर कॉल किए जाने की प्रतीक्षा करें। शीर्ष तीन पैनल पूरे रन के लिए सारांश भूखंड दिखाते हैं।
प्लॉट एक सूचकांक संदर्भ जीनोम पर न्यूक्लियोटाइड स्थिति प्रति प्रत्येक बारकोड के लिए मैप किए गए रीड के कवरेज की गहराई को दर्शाता है। प्लॉट दो शो मैप किए गए समय के साथ सभी बारकोड से पढ़ते हैं, और प्लॉट तीन शो मैप किए गए बारकोड प्रति पढ़ते हैं। निचले पैनल प्रति बारकोड भूखंडों की पंक्तियाँ दिखाते हैं।
बाईं ओर सूचकांक संदर्भ जीनोम पर न्यूक्लियोटाइड स्थिति प्रति मैप किए गए रीड्स के कवरेज की गहराई को दर्शाता है। मैप किए गए रीड्स की लंबाई वितरण बीच में है। समय के साथ मैप किए गए रीड्स के 10x, 100x और 1000x कवरेज प्राप्त करने वाले इंडेक्स संदर्भ जीनोम पर न्यूक्लियोटाइड पदों का अनुपात दाहिने कोने में देखा जाता है।
सर्वसम्मति अनुक्रमों के वंश असाइनमेंट के लिए, मैडडॉग का उपयोग करें। नवीनतम संस्करण के साथ काम करना सुनिश्चित करने के लिए GitHub से MadDog रिपॉजिटरी खींचें। पहले बनाए गए स्थानीय मैडडॉग रिपॉजिटरी के भीतर एक फ़ोल्डर बनाएं।
फ़ोल्डर के अंदर, fastA फ़ाइल जोड़ें जिसमें सर्वसम्मति अनुक्रम हैं। साथ ही, फ़ोल्डर में मेटाडेटा फ़ाइल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि यह फ़ाइल एक CSV है जिसमें ID, देश, वर्ष और असाइनमेंट नामक चार कॉलम हैं.
नवीनतम संस्करण के साथ काम करना सुनिश्चित करने के लिए GitHub से MadDog रिपॉजिटरी खींचें। कमांड लाइन इंटरफ़ेस में, conda वातावरण को conda सक्रिय MADDOG कमांड के साथ सक्रिय करें। कमांड लाइन इंटरफ़ेस में, मैडडॉग रिपॉजिटरी फ़ोल्डर में नेविगेट करें।
सबसे पहले, संभावित असामान्यताओं की जांच करने के लिए अनुक्रमों पर वंश असाइनमेंट करें और यह पहचानें कि एसएच असाइनमेंट चलाकर लंबे वंश पदनाम चरण चलाना उचित है या नहीं। श कमांड। संकेत मिलने पर, यह पुष्टि करने के लिए Y दर्ज करें कि रिपॉजिटरी खींची गई है और MadDog के नवीनतम संस्करण के साथ काम कर रही है।
संकेत मिलने पर, MadDog रिपॉजिटरी के भीतर fastA फ़ाइल वाले फ़ोल्डर का नाम दर्ज करें। जब वंश असाइनमेंट पूरा हो जाए, तो फ़ोल्डर में आउटपुट फ़ाइल की जांच करें। यदि आउटपुट अपेक्षित है और एक ही वंश को कई अनुक्रम सौंपे गए हैं, तो वंश पदनाम चलाएं।
वंश पदनाम चलाते समय, अभी बनाई गई असाइनमेंट आउटपुट फ़ाइल को हटा दें। मैडडॉग रिपॉजिटरी फ़ोल्डर के अंदर टर्मिनल में, श designation.sh कमांड चलाएं। जब संकेत दिया जाता है, तो यह इंगित करने के लिए Y दर्ज करें कि रिपॉजिटरी खींची गई है और काम MadDog के सबसे अद्यतित संस्करण के साथ किया जा रहा है।
संकेत मिलने पर, MadDog रिपॉजिटरी फ़ोल्डर के भीतर फ़ोल्डर का नाम दर्ज करें जिसमें fastA फ़ाइल और मेटाडेटा है। रेबीज वायरस आरएबीवी के लिए व्याख्या वर्कफ़्लो के अनुक्रम के लिए नमूना तंजानिया, केन्या, नाइजीरिया और फिलीपींस जैसे स्थानिक देशों में विभिन्न प्रयोगशाला स्थितियों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था। रामपार्ट का उपयोग करके लाइव बेस कॉलिंग ने रीड्स की वास्तविक समय पीढ़ी और प्रति नमूना प्रतिशत कवरेज दिखाया।
एक वंश वर्गीकरण और नामकरण प्रणाली, मैडडॉग, जिसका उपयोग परिणामी आरएबीवी अनुक्रमों को संकलित और व्याख्या करने के लिए किया जाता है, ने मैडडॉग असाइनमेंट के बाद स्थानीय वंशों के उच्च रिज़ॉल्यूशन वर्गीकरण को दिखाया।