Börja prima och ladda den kvalitetskontrollerade flödescellen genom att fälla tillbaka sekvenseringsenhetens lock och skjuta primingportens lock medurs, visualisera primingporten. För att ta bort luftbubblor, ställ in en P 1000-pipett på 200 mikroliter och sätt in pipettspetsen vertikalt i primingporten. Vrid hjulet tills en liten volym som kommer in i pipettspetsen syns.
Ladda 800 mikroliter förberedd fyllningsblandning från flödescellen via primingporten för att undvika att bubblor införs. Lyft upp provportens lock och fyll på 200 mikroliter av den återstående primingblandningen i flödescellen via primingporten. För att säkerställa blandningen av laddningspärlorna, återsuspendera bibliotekets masterblandning genom pipettering och droppvis, ladda 75 mikroliter till flödescellen via sample port.
Sätt tillbaka sample portkåpan försiktigt och se till att tappen kommer in i sample port. Stäng primingporten och sätt tillbaka sekvenseringsenhetens lock. För live-basanrop, använd Rampart.
Använd den arktiska RabV-miljön och arbeta i katalogen som skapats för Rampart-utdata. Skriv sedan kommandot Rampart för att navigera till de sökvägar som krävs. Först det Rampart-specifika schemaprotokollet, och nästa bas som kallas path, utdatamappen mino fastq pass för körningen.
Öppna ett webbläsarfönster och navigera till lokal värd 3000 i URL-rutan. Vänta tills tillräckligt med data har basanropats innan resultaten visas på skärmen. De tre översta panelerna visar sammanfattande diagram för hela körningen.
Diagram ett visar täckningsdjupet för kartlagda avläsningar för varje streckkod per nukleotidposition på indexreferensgenomet. Diagram två visar mappade läsningar från alla streckkoder över tid, och diagram tre visar mappade läsningar per streckkod. Nedre paneler visar rader med diagram per streckkod.
Till vänster visas täckningsdjupet för kartlagda avläsningar per nukleotidposition på indexreferensgenomet. Längdfördelningen för mappade läsningar är i mitten. Andelen nukleotidpositioner på indexreferensgenomet som får 10x, 100x och 1000x täckning av kartlagda avläsningar över tid ses i det högra hörnet.
För ursprungstilldelning av konsensussekvenser använder du MadDog. Hämta MadDog-lagringsplatsen från GitHub för att säkerställa att du arbetar med den senaste versionen. Skapa en mapp i den tidigare skapade lokala MadDog-lagringsplatsen.
I mappen lägger du till fastA-filen som innehåller konsensussekvenserna. Lägg också till en metadatafil i mappen. Se till att den här filen är en CSV-fil med fyra kolumner som heter ID, land, år och tilldelning.
Hämta MadDog-lagringsplatsen från GitHub för att säkerställa att du arbetar med den senaste versionen. I kommandoradsgränssnittet aktiverar du conda-miljön med ett conda activate MADDOG-kommando. I kommandoradsgränssnittet navigerar du till MadDog-lagringsplatsens mapp.
Utför först ursprungstilldelning på sekvenser för att söka efter potentiella avvikelser och identifiera om det är lämpligt att köra det längre härledningsbeteckningssteget genom att köra sh-tilldelningen. sh-kommandot. När du uppmanas till det anger du Y för att bekräfta att lagringsplatsen hämtas och fungerar med MadDogs senaste version.
När du uppmanas till det anger du mappnamnet som innehåller fastA-filen i MadDog-arkivet. När ursprungstilldelningen är klar kontrollerar du utdatafilen i mappen. Om utdata är som förväntat och flera sekvenser tilldelas till samma ursprung kör du ursprungsbeteckningen.
När du kör ursprungsbeteckning tar du bort tilldelningsutdatafilen som nyss skapades. I terminalen i MadDog-lagringsmappen kör du kommandot sh designation.sh. När du uppmanas till det anger du Y för att indikera att lagringsplatsen har hämtats och att arbetet utförs med den senaste versionen av MadDog.
När du uppmanas till det anger du mappnamnet i MadDog-lagringsplatsmappen som innehåller fastA-filen och metadata. Arbetsflödet för rabiesvirus RABV användes framgångsrikt i olika laboratorieförhållanden i endemiska länder som Tanzania, Kenya, Nigeria och Filippinerna. Livebasanropet med Rampart visade realtidsgenereringen av läsningar och den procentuella täckningen per exempel.
Ett härstamningsklassificerings- och nomenklatursystem, MadDog, som användes för att sammanställa och tolka resulterande RABV-sekvenser visade den högre upplösningsklassificeringen av lokala linjer efter MadDog-uppdraget.